Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.

Abstract

Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2'-7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака - HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.

Introduction

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках 1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАД....

Protocol

1. Клеточная культура

  1. Засейте исследуемые клетки (клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, HUH7 и JHH4) в 96-луночную пластину с плотностью засева 10 000 клеток/лунку при конечном объеме посева 200 мкл на лунку.
    1. Перед культивированием клеток HepG2 покройте 96 лунок для планшетов кол?.......

Representative Results

Дигидроэтидий (ДГЭ) представляет собой супероксид-чувствительный флуоресцентный краситель, который предоставляет специфическую информацию о внутриклеточных состояниях АФК. Краситель DHE по своей природе излучает синюю флуоресценцию в цитоплазме. Однако при взаимодействии с суперокс.......

Discussion

В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, досту.......

Acknowledgements

РК и RRG были поддержаны грантом Центра металлов в биологии и медицине UNM (CMBM) через грант NIH NIGMS P20 GM130422. RRG была поддержана пилотной премией из гранта NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Поддержка ядра визуализации для инструмента CX7 Cellomics была обеспечена через ядра центра AIM, финансируемые грантом NIH P20GM121176. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Шарину Десаи и д-ра Ли Чена за их неоценимую помощь в решении технических вопросов, связанных с использованием платформы визуализации CX7 Cellomics.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubes VWR 20170-038 
96- well plate Corning Costar 07-200-90 
Cellomics Cx7ThermoFisher HCSDCX7LEDPRO
Collagen Advanced Biomatrix  5056 
DHE (Dihydroethidium) ThermoFisher D1168 
DMEM Sigma  6046 
FBS VWR 97068-085 
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
HepG2 cell lineATCC
Hoechst ThermoFisher 33342 
HUH7 cell lineATCC
Hydrogen Peroxide Sigma 88597 
JHH4 cell lineATCC
Menadione Sigma M5625 

References

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved