A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.
Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2'-7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака - HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.
Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках 1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАД....
1. Клеточная культура
Дигидроэтидий (ДГЭ) представляет собой супероксид-чувствительный флуоресцентный краситель, который предоставляет специфическую информацию о внутриклеточных состояниях АФК. Краситель DHE по своей природе излучает синюю флуоресценцию в цитоплазме. Однако при взаимодействии с суперокс.......
В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, досту.......
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
РК и RRG были поддержаны грантом Центра металлов в биологии и медицине UNM (CMBM) через грант NIH NIGMS P20 GM130422. RRG была поддержана пилотной премией из гранта NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Поддержка ядра визуализации для инструмента CX7 Cellomics была обеспечена через ядра центра AIM, финансируемые грантом NIH P20GM121176. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Шарину Десаи и д-ра Ли Чена за их неоценимую помощь в решении технических вопросов, связанных с использованием платформы визуализации CX7 Cellomics.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
DMEM | Sigma | 6046 | |
FBS | VWR | 97068-085 | |
GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
HepG2 cell line | ATCC | ||
Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
HUH7 cell line | ATCC | ||
Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
JHH4 cell line | ATCC | ||
Menadione | Sigma | M5625 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved