Высокопроизводительная скрининговая оценка генерации активных форм кислорода (АФК) с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ)

Summary

В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.

Abstract

Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2'-7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака - HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.

Introduction

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках ^1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАД....

Protocol

1. Клеточная культура

1. Засейте исследуемые клетки (клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2, HUH7 и JHH4) в 96-луночную пластину с плотностью засева 10 000 клеток/лунку при конечном объеме посева 200 мкл на лунку.
   1. Перед культивированием клеток HepG2 покройте 96 лунок для планшетов кол?.......

Discussion

В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, досту.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625