Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Summary

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Abstract

La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.

Introduction

L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi¹. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità². Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia³. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.

1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti

1. Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggio
   1. Terreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere

Discussion

Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo¹⁵. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigener.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor