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* These authors contributed equally
Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.
La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.
L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali
Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.
1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti
Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l'aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteli.......
Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigener.......
Nessuno.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
Taurine | Sigma | T0625-10G | |
Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
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