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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l'adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Abstract

La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l'approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.

Introduction

L'occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell'Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall'Istituto di Ricerca WiCell.

1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti

  1. Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggio
    1. Terreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere

Representative Results

Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l'aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteli.......

Discussion

Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l'RO umana rispecchia da vicino l'effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigener.......

Acknowledgements

Nessuno.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.01 M TPBSServicebioG0002Washing slices
4% ParaformaldehydeServicebioG1101-500MLFix retinal organoids
5 mL Pasteur pipetteNEST Biotechnology318516Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wellsSumitomo BakelitMS-9096VZ
Adhesion Microscope SlidesCITOTEST188105Fix slices
AggreWell mediumSTEMCELL Technologies5893Medium
Anhydrous ethanolSINOPHARM10009218Dehydrate 
Anti-CHX10Santa Cruzsc-365519Primary antibody
Antifade SolutionZSGB-BIOZLI-9556
Anti-KI67Abcamab16667Primary antibody
Anti-NESTINSigmaN5413Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)BeyotimeAT809Primary antibody
Anti-PAX6Abcamab195045Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)STEMCELL Technologies7922Cell dissociation
CHIR99021SelleckchemS2924GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid ConcentrateGibco12531018250×
Citrate Antigen Retrieval SolutionServicebioG1202-250ML20×, pH 6.0
CS10STEMCELL Technologies1001061Cell Freezing Medium
DAPIRoche10236276001Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)SigmaD2650
DMEM/F12Gibco11330032Medium
DMEM/F12-GlutaMAXGibco10565018Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32766Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568InvitrogenA10042Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)BiosharpBL518A0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)Corning354277Coating plates
F12-GlutamaxGibco31765035Medium
Fetal Bovine SerumGibcoA5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzerTissueGnosticsTissueFAXS PlusScan sections
IMDM-GlutaMAXGibco31980030Medium
IWR1-endoSelleckchemS7086Wnt-inhibitor
KnockOut Serum ReplacementGibco10828028
LDN-193189 2HClSelleckchemS7507BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well PlatesCorning3473
Low-adhesion 6-well PlatesCorning3471
Maintenance medium (MM)STEMCELL Technologies85850Medium
N2 supplementGibco17502048
Normal Donkey SerumSolarbioSL050Blocking buffer
ParaplastLeica39601006Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)GibcoC10010500BTWithout Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)R&D314-BPKey protein factor
Retinoic acidSigmaR2625Powder, keep out of light
SB431542SelleckchemS1067ALK5-inhibitor
SU5402SelleckchemS7667Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP PenZSGB-BIOZLI-9305
TaurineSigmaT0625-10G
ThioglycerolSigmaM1753
Triton X-100SigmaX100Permeabilization
WA09 embryonic stem cell lineWiCell Research InstituteCell line
XyleneSINOPHARM10023418Dewaxing
Y-27632 2HCLSelleckchemS1049ROCK-inhibitor

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al.

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