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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Um procedimento simples para a criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas é descrito. Apenas uma cepa de Wolbachia foi detectada em cada ínstar de D. antiqua axênica por PCR.

Abstract

Os insetos axênicos são obtidos a partir de sistemas de criação artificial estéreis usando meios estéreis. Esses insetos, caracterizados por seu pequeno tamanho, ciclo de crescimento curto e baixa exigência alimentar, são ideais para estudar a relação entre microrganismos e hospedeiros. A microbiota intestinal influencia significativamente as características fisiológicas dos insetos hospedeiros, e a introdução de cepas específicas em insetos axênicos fornece um método para verificar as funções microbianas intestinais. Delia antiqua, uma praga ameaçadora da ordem Diptera, família Anthomyiidae e gênero Delia, alimenta-se principalmente de cebola, alho, alho-poró e outros vegetais da família Liliaceae. Suas larvas se alimentam dos bulbos, causando apodrecimento, murcha e até morte de plantas inteiras. Através da criação de larvas axênicas, estudos de seguimento podem ser realizados para observar os efeitos da microflora intestinal sobre o crescimento e desenvolvimento de D. antiqua. Ao contrário do método que envolve a eliminação antibiótica de micróbios associados, este artigo apresenta uma abordagem de baixo custo e alta eficiência para a elevação de D. antiqua axênica. Após a esterilização superficial dos ovos de D. antiqua , dietas estéreis semifermentadas foram utilizadas para criar larvas, e o estado axênico de D. antiqua foi verificado através de ensaios dependentes e independentes de cultura. Conclui-se que a combinação da esterilização de ovos de insetos e o preparo de dietas estéreis para cultivo de larvas possibilitou o desenvolvimento de um método eficiente e simples para obtenção de D. antiqua axênica. Este método fornece uma abordagem poderosa para estudar interações inseto-microflora.

Introduction

Animais axênicos, definidos como animais nos quais não é possível detectar microrganismos ou parasitas viáveis, são modelos experimentais valiosos para o estudo das interações hospedeiro-microrganismo1,2. Os insetos, o maior grupo de invertebrados, podem formar relações simbióticas com microrganismos3. Insetos axênicos podem ser usados para estudar interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos4. Por exemplo, Nishide et al.5 estabeleceram um procedimento prático de criação estéril para o verme de mau odor Plautia stali, p....

Protocol

D. antiqua são obtidos do campo de Fanzhen, Taian.

1. Preparação de dietas estéreis

  1. Descasque as camadas externas das cebolinhas e descarte as folhas verdes. Manter a parte branca das cebolinhas (Figura 1A) e lavá-las com água estéril, repetindo o processo de enxágue três vezes. Cortar a parte branca das cebolinhas em pedaços cortados em cubos de 1-2 cm utilizando uma tesoura (ver Tabela de Materiais) esteriliz.......

Representative Results

Os estágios de vida de D. antiqua estão representados na Figura 4. O ciclo de vida completo compreende ovos, larvas, pupas (Figura 4C) e adultos (Figura 4D). São cultivados em tubos centrífugos estéreis, e sua aparência e taxa de sobrevivência são indistinguíveis de D. antiqua criadas sob condições não-axênicas. Os tempos de crescimento e desenvolvimento para cada estágio de D. antiqua podem .......

Discussion

Os insetos possuem uma microbiota intestinal altamente complexa20,21, sendo necessário o uso de insetos axênicos inoculados com cepas microbianas intestinais específicas para o estudo das interações inseto-microrganismo. A preparação de insetos axênicos é crucial para tais esforços de pesquisa. O tratamento com antibióticos é um método usado para eliminar a microbiota intestinal. Por exemplo, Jung e Kim22 alimentaram Spodo.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32272530), pelo Projeto Novas Vinte Políticas para a Universidade em Jinan (2021GXRC040), Grandes Projetos de Inovação Científica e Tecnológica na Província de Shandong (2021TZXD002) e pelo Projeto de Integração de Ciência e Educação da Universidade de Tecnologia Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μM filter bottleThermo Scientific450-0045
0.22 μM Syringe FilterBiosharpBS-QT-011
100-mesh sieveZhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve FactoryNo Catalog numbers
1x PBS solutionSolarbioP1020
2x Taq PCR Master MixGENVIEWGR1113-1ML
5.2% NaClO solutionSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.80010428
500 mL Conical flaskThermo Scientific4103-0500
50 mL vented centrifuge tubeJET BIOFILBRT-011-050
50x TAE bufferGENVIEWGT1307
Agar powderDing GuoDH010-1.1
Biochemical incubatorSTIK21040121500010
Cell sieveSAINING5022200
Choline chlorideSangon BiotechA600299-0100
ddH2ODing GuoPER018-2
Disposable grinding pestleJET BIOFILCSP-003-002
DNA extraction kitSangon BiotechB518221-0050
DNA MarkerSangon BiotechB600335-0250
Ethanol absoluteSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
Filter paperNEWSTAR1087309025
Food processorGuangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd.WBL25B26
Illuminated  incubatorShanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd.A16110768
L-Ascorbic acidSangon BiotechA610021-0100
L-shaped spreaderSAINING6040000
Nutrient agar mediumHope BioHB0109
ScissorsBing Yu BY-103Purchase on Jingdong
Shock incubatorShanghai Zhichu Instrument Co., Ltd.2020000014
SucroseGENVIEWCS326-500G
Super Green nucleic acid dyeBiosharpBS355A
Super-clean tableHeal ForceAC130052
TSBHope BioHB4114
Vacuum pumpZhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd.22051031
Yeast extractThermo ScientificLP0021B

References

  1. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  2. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-....

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