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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Abstract

O peixe-zebra é um intrigante organismo modelo conhecido por sua notável capacidade de regeneração cardíaca. O estudo da contração cardíaca in vivo é essencial para obter informações sobre mudanças estruturais e funcionais em resposta a lesões. No entanto, a obtenção de imagens 4-dimensionais (4D, espaciais 3D + temporais) de alta resolução e alta velocidade do coração do peixe-zebra para avaliar a arquitetura e contratilidade cardíaca permanece um desafio. Neste contexto, um microscópio de folha de luz (LSM) interno e análises computacionais personalizadas são usados para superar essas limitações técnicas. Essa estratégia, envolvendo a construção do sistema LSM, sincronização retrospectiva, rastreamento de célula única e análise dirigida ao usuário, permite investigar a microestrutura e a função contrátil em todo o coração na resolução de célula única nas larvas transgênicas de peixe-zebra Tg(myl7:nucGFP). Além disso, podemos incorporar ainda mais a microinjeção de compostos de pequenas moléculas para induzir lesão cardíaca de forma precisa e controlada. Em geral, esse quadro permite rastrear as mudanças fisiológicas e fisiopatológicas, bem como a mecânica regional em nível unicelular durante a morfogênese e regeneração cardíaca.

Introduction

O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo modelo amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento, fisiologia e reparo cardíaco devido à sua transparência óptica, tratabilidade genética e capacidade regenerativa 1,2,3,4. No infarto do miocárdio, enquanto alterações estruturais e funcionais impactam a ejeção cardíaca e hemodinâmica, limitações técnicas continuam dificultando a capacidade de investigar o processo dinâmico durante a regeneração cardíaca com alta resolução espaço-temporal. Por exemplo, os métodos de imagem convencio....

Protocol

A aprovação para este estudo foi concedida pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Texas em Dallas, sob o número de protocolo #20-07. Tg(myl7:nucGFP) larvastransgênicas de zebrafish 12 foram utilizadas para o presente estudo. Toda a aquisição de dados e pós-processamento das imagens foram realizadas utilizando-se softwares de código aberto ou plataformas com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos são disponibilizados pelos autores m.......

Representative Results

O protocolo atual consiste em três etapas principais: preparação e microinjeção de peixe-zebra, imagem de folha de luz e reconstrução de imagens 4D, e rastreamento celular e interação com RV. Peixes-zebra adultos foram deixados acasalar, os ovos fertilizados foram coletados e realizada microinjeção conforme necessário para os experimentos propostos (Figura 1). Esta etapa fornece um ponto de entrada para explorar as aplicações do peixe-zebra na investigação do desenvolvimento .......

Discussion

A integração do modelo do peixe-zebra com métodos de engenharia tem imenso potencial para a exploração in vivo de infarto do miocárdio, arritmias e defeitos cardíacos congênitos. Aproveitando sua transparência óptica, capacidade regenerativa e semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos, embriões e larvas de peixe-zebra têm se tornado extensivamente utilizados em pesquisas 1,2,4. A resolução espaç.......

Acknowledgements

Expressamos nossa gratidão à Dra. Caroline Burns, do Hospital Infantil de Boston, por compartilhar generosamente o peixe-zebra transgênico. Agradecemos à Sra. Elizabeth Ibanez por sua ajuda na criação de peixes-zebra na UT Dallas. Também agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) e pelo programa UT Dallas STARS (Y.D.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RESOURCESOURCE/ReferenceIDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafishBurns Lab in Boston Children's HospitalZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLABThe MathWorks Inc.R2023a
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
PythonThe Python Software Foundation3.9.0
Fiji-ImageJSchneider et al.181.54f
3DeeCellTrackerChentao Wen et al.15v0.5.2
UnityUnity Software Inc.2020.3.2f1
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
3D SlicerAndriy Fedorov et al.175.2.1
ITK SNAPPaul A Yushkevich et al.164
Light-sheet system
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
4X Illumination objectiveNikonMRH00045
20X Detection objectiveOlympus1-U2M585
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Motorized XYZ stageThorlabsPT3/M-Z8
Two-axis tilt stageThorlabsGN2/M
Rotation stepper motorPololu1474
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
473nm DPSS LaserLaserglowR471003GX
532nm DPSS laserLaserglowR531003FX
Microinjector and vacuum pump
MicroinjectorWPIPV850
Vacuum pumpWelch2522B-01
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LT
Capillary tip for gel loadingBio-Rad2239912
Virtual reality hardware
VR headsetMetaQuest 2
30mg/L PTU solution
PTUSigma-AldrichP7629
1X E3 working solution--
1% Agarose--
Low-melt agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
10g/L Tricaine stock solution
TricaineSyndelSYNC-M-GR-US02
Deionized water--
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution--
Deionized water--
60X E3 stock solution
Sodium ChlorideLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at DallasNaCl
Potassium Chloride-KCL
Calcium Chloride Dihydrate-CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate-MgSO4 x 7H2O
RO Water--
1X E3 working solution
60X E3 stock solutionLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas-
RO Water--
1% Methylene Blue (optional) -C16H18ClN3S

References

  1. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  2. Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development.

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