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Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra
In This Article
Summary
Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.
Abstract
O peixe-zebra é um intrigante organismo modelo conhecido por sua notável capacidade de regeneração cardíaca. O estudo da contração cardíaca in vivo é essencial para obter informações sobre mudanças estruturais e funcionais em resposta a lesões. No entanto, a obtenção de imagens 4-dimensionais (4D, espaciais 3D + temporais) de alta resolução e alta velocidade do coração do peixe-zebra para avaliar a arquitetura e contratilidade cardíaca permanece um desafio. Neste contexto, um microscópio de folha de luz (LSM) interno e análises computacionais personalizadas são usados para superar essas limitações técnicas. Essa estratégia, envolvendo a construção do sistema LSM, sincronização retrospectiva, rastreamento de célula única e análise dirigida ao usuário, permite investigar a microestrutura e a função contrátil em todo o coração na resolução de célula única nas larvas transgênicas de peixe-zebra Tg(myl7:nucGFP). Além disso, podemos incorporar ainda mais a microinjeção de compostos de pequenas moléculas para induzir lesão cardíaca de forma precisa e controlada. Em geral, esse quadro permite rastrear as mudanças fisiológicas e fisiopatológicas, bem como a mecânica regional em nível unicelular durante a morfogênese e regeneração cardíaca.
Introduction
O peixe-zebra (Danio rerio) é um organismo modelo amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento, fisiologia e reparo cardíaco devido à sua transparência óptica, tratabilidade genética e capacidade regenerativa 1,2,3,4. No infarto do miocárdio, enquanto alterações estruturais e funcionais impactam a ejeção cardíaca e hemodinâmica, limitações técnicas continuam dificultando a capacidade de investigar o processo dinâmico durante a regeneração cardíaca com alta resolução espaço-temporal. Por exemplo, os métodos de imagem convencio....
Protocol
A aprovação para este estudo foi concedida pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade do Texas em Dallas, sob o número de protocolo #20-07. Tg(myl7:nucGFP) larvastransgênicas de zebrafish 12 foram utilizadas para o presente estudo. Toda a aquisição de dados e pós-processamento das imagens foram realizadas utilizando-se softwares de código aberto ou plataformas com licenças de pesquisa ou educacionais. Os recursos são disponibilizados pelos autores m.......
Representative Results
O protocolo atual consiste em três etapas principais: preparação e microinjeção de peixe-zebra, imagem de folha de luz e reconstrução de imagens 4D, e rastreamento celular e interação com RV. Peixes-zebra adultos foram deixados acasalar, os ovos fertilizados foram coletados e realizada microinjeção conforme necessário para os experimentos propostos (Figura 1). Esta etapa fornece um ponto de entrada para explorar as aplicações do peixe-zebra na investigação do desenvolvimento .......
Discussion
A integração do modelo do peixe-zebra com métodos de engenharia tem imenso potencial para a exploração in vivo de infarto do miocárdio, arritmias e defeitos cardíacos congênitos. Aproveitando sua transparência óptica, capacidade regenerativa e semelhanças genéticas e fisiológicas com humanos, embriões e larvas de peixe-zebra têm se tornado extensivamente utilizados em pesquisas 1,2,4. A resolução espaç.......
Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgements
Expressamos nossa gratidão à Dra. Caroline Burns, do Hospital Infantil de Boston, por compartilhar generosamente o peixe-zebra transgênico. Agradecemos à Sra. Elizabeth Ibanez por sua ajuda na criação de peixes-zebra na UT Dallas. Também agradecemos todos os comentários construtivos fornecidos pelos membros da incubadora D na UT Dallas. Este trabalho foi apoiado pelo NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) e pelo programa UT Dallas STARS (Y.D.).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
| Animal models | |||
| Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
| Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
| 3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
| Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| 3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
| ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
| Light-sheet system | |||
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| 4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
| 20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
| Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
| Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
| Microinjector and vacuum pump | |||
| Microinjector | WPI | PV850 | |
| Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
| Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
| Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
| Virtual reality hardware | |||
| VR headset | Meta | Quest 2 | |
| 30mg/L PTU solution | |||
| PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 1X E3 working solution | - | - | |
| 1% Agarose | - | - | |
| Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| 10g/L Tricaine stock solution | |||
| Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
| Deionized water | - | - | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| 150mg/L Tricaine working solution | |||
| 10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
| Deionized water | - | - | |
| 60X E3 stock solution | |||
| Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
| Potassium Chloride | - | KCL | |
| Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
| RO Water | - | - | |
| 1X E3 working solution | |||
| 60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
| RO Water | - | - | |
| 1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
References
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development.
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