Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол использует визуализацию светового листа для исследования сократительной функции сердца у личинок данио-рерио и получения информации о механике сердца с помощью отслеживания клеток и интерактивного анализа.

Abstract

Рыбка данио-рерио – это интригующий модельный организм, известный своей замечательной способностью к регенерации сердца. Изучение сокращающегося сердца in vivo имеет важное значение для получения информации о структурных и функциональных изменениях в ответ на травмы. Тем не менее, получение высокоскоростных 4-мерных (4D, 3D пространственных + 1D временных) изображений сердца рыбки данио для оценки сердечной архитектуры и сократимости сердца остается сложной задачей. В этом контексте для преодоления этих технических ограничений используется собственный световой микроскоп (LSM) и специализированный вычислительный анализ. Эта стратегия, включающая построение системы LSM, ретроспективную синхронизацию, отслеживание отдельных клеток и управляемый пользователем анализ, позволяет исследовать микроструктуру и сократительную функцию по всему сердцу с одноклеточным разрешением у трансгенных личинок Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, мы можем дополнительно использовать микроинъекции низкомолекулярных соединений для точного и контролируемого вызова сердечного поражения. В целом, эта система позволяет отслеживать физиологические и патофизиологические изменения, а также региональную механику на уровне отдельных клеток в процессе морфогенеза и регенерации сердца.

Introduction

Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом для изучения сердечного развития, физиологии и восстановления благодаря своей оптической прозрачности, генетической податливости и регенеративной способности 1,2,3,4. При инфаркте миокарда, в то время как структурные и функциональные изменения влияют на выброс сердца и гемодинамику, технические ограничения продолжают препятствовать возможности исследовать динамический процесс во время регенерации сердца с высоким пространственно-временным разрешением. ....

Protocol

Разрешение на проведение этого исследования было выдано Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Техасского университета в Далласе под номером протокола #20-07. Для настоящего исследования использовали12 трансгенных личинок данио-рерио Tg(myl7:nucGFP). Весь сбо.......

Representative Results

Текущий протокол состоит из трех основных этапов: подготовка рыбок данио и микроинъекция, визуализация светового листа и реконструкция 4D-изображения, а также отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью. Взрослым рыбкам данио-рерио было позволено спариваться, оплод.......

Discussion

Интеграция модели рыбки данио с инженерными методами имеет огромный потенциал для исследования in vivo инфаркта миокарда, аритмий и врожденных пороков сердца. Используя свою оптическую прозрачность, регенеративную способность, а также генетическое и физиологическое сходство с чел?.......

Acknowledgements

Мы выражаем нашу благодарность доктору Кэролайн Бернс из Бостонской детской больницы за то, что она щедро поделилась трансгенными рыбками данио. Мы благодарим г-жу Элизабет Ибаньес за ее помощь в разведении рыбок данио-рерио в UT Dallas. Мы также ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в UT Dallas. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и UT Dallas STARS program (Y.D.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RESOURCESOURCE/ReferenceIDENTIFIER
Animal models
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafishBurns Lab in Boston Children's HospitalZDB-TGCONSTRCT-070117-49
Software and algorithms
MATLABThe MathWorks Inc.R2023a
LabVIEWNational Instruments Corporation2017 SP1
HCImage LiveHamamatsu Photonics4.6.1.2
PythonThe Python Software Foundation3.9.0
Fiji-ImageJSchneider et al.181.54f
3DeeCellTrackerChentao Wen et al.15v0.5.2
UnityUnity Software Inc.2020.3.2f1
AmiraThermo Fisher Scientific2021.2
3D SlicerAndriy Fedorov et al.175.2.1
ITK SNAPPaul A Yushkevich et al.164
Light-sheet system
Cylindrical lensThorlabsACY254-050-A
4X Illumination objectiveNikonMRH00045
20X Detection objectiveOlympus1-U2M585
sCMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
Motorized XYZ stageThorlabsPT3/M-Z8
Two-axis tilt stageThorlabsGN2/M
Rotation stepper motorPololu1474
Fluorescent beadsSpherotechFP-0556-2
473nm DPSS LaserLaserglowR471003GX
532nm DPSS laserLaserglowR531003FX
Microinjector and vacuum pump
MicroinjectorWPIPV850
Vacuum pumpWelch2522B-01
Pre-Pulled Glass PipettesWPITIP10LT
Capillary tip for gel loadingBio-Rad2239912
Virtual reality hardware
VR headsetMetaQuest 2
30mg/L PTU solution
PTUSigma-AldrichP7629
1X E3 working solution--
1% Agarose--
Low-melt agaroseThermo Fisher16520050
Deionized water--
10g/L Tricaine stock solution
TricaineSyndelSYNC-M-GR-US02
Deionized water--
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
150mg/L Tricaine working solution
10g/L Tricaine stock solution--
Deionized water--
60X E3 stock solution
Sodium ChlorideLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at DallasNaCl
Potassium Chloride-KCL
Calcium Chloride Dihydrate-CaCL2 x 2H2O
Magnesium Sulfate Heptahydrate-MgSO4 x 7H2O
RO Water--
1X E3 working solution
60X E3 stock solutionLab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas-
RO Water--
1% Methylene Blue (optional) -C16H18ClN3S

References

  1. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat. Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  2. Liu, J., Stainier, D. Y. R. Zebrafish in the study of early cardiac development.

Explore More Articles

JoVE2034DVR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved