A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол использует визуализацию светового листа для исследования сократительной функции сердца у личинок данио-рерио и получения информации о механике сердца с помощью отслеживания клеток и интерактивного анализа.
Рыбка данио-рерио – это интригующий модельный организм, известный своей замечательной способностью к регенерации сердца. Изучение сокращающегося сердца in vivo имеет важное значение для получения информации о структурных и функциональных изменениях в ответ на травмы. Тем не менее, получение высокоскоростных 4-мерных (4D, 3D пространственных + 1D временных) изображений сердца рыбки данио для оценки сердечной архитектуры и сократимости сердца остается сложной задачей. В этом контексте для преодоления этих технических ограничений используется собственный световой микроскоп (LSM) и специализированный вычислительный анализ. Эта стратегия, включающая построение системы LSM, ретроспективную синхронизацию, отслеживание отдельных клеток и управляемый пользователем анализ, позволяет исследовать микроструктуру и сократительную функцию по всему сердцу с одноклеточным разрешением у трансгенных личинок Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, мы можем дополнительно использовать микроинъекции низкомолекулярных соединений для точного и контролируемого вызова сердечного поражения. В целом, эта система позволяет отслеживать физиологические и патофизиологические изменения, а также региональную механику на уровне отдельных клеток в процессе морфогенеза и регенерации сердца.
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом для изучения сердечного развития, физиологии и восстановления благодаря своей оптической прозрачности, генетической податливости и регенеративной способности 1,2,3,4. При инфаркте миокарда, в то время как структурные и функциональные изменения влияют на выброс сердца и гемодинамику, технические ограничения продолжают препятствовать возможности исследовать динамический процесс во время регенерации сердца с высоким пространственно-временным разрешением. ....
Разрешение на проведение этого исследования было выдано Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Техасского университета в Далласе под номером протокола #20-07. Для настоящего исследования использовали12 трансгенных личинок данио-рерио Tg(myl7:nucGFP). Весь сбо.......
Текущий протокол состоит из трех основных этапов: подготовка рыбок данио и микроинъекция, визуализация светового листа и реконструкция 4D-изображения, а также отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью. Взрослым рыбкам данио-рерио было позволено спариваться, оплод.......
Интеграция модели рыбки данио с инженерными методами имеет огромный потенциал для исследования in vivo инфаркта миокарда, аритмий и врожденных пороков сердца. Используя свою оптическую прозрачность, регенеративную способность, а также генетическое и физиологическое сходство с чел?.......
У авторов нет конфликта интересов, который они могли бы раскрыть.
Мы выражаем нашу благодарность доктору Кэролайн Бернс из Бостонской детской больницы за то, что она щедро поделилась трансгенными рыбками данио. Мы благодарим г-жу Элизабет Ибаньес за ее помощь в разведении рыбок данио-рерио в UT Dallas. Мы также ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в UT Dallas. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и UT Dallas STARS program (Y.D.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
Animal models | |||
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
Light-sheet system | |||
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
Microinjector and vacuum pump | |||
Microinjector | WPI | PV850 | |
Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
Virtual reality hardware | |||
VR headset | Meta | Quest 2 | |
30mg/L PTU solution | |||
PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
1X E3 working solution | - | - | |
1% Agarose | - | - | |
Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | - | - | |
10g/L Tricaine stock solution | |||
Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
Deionized water | - | - | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
150mg/L Tricaine working solution | |||
10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
Deionized water | - | - | |
60X E3 stock solution | |||
Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
Potassium Chloride | - | KCL | |
Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
RO Water | - | - | |
1X E3 working solution | |||
60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
RO Water | - | - | |
1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved