A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол использует визуализацию светового листа для исследования сократительной функции сердца у личинок данио-рерио и получения информации о механике сердца с помощью отслеживания клеток и интерактивного анализа.
Рыбка данио-рерио – это интригующий модельный организм, известный своей замечательной способностью к регенерации сердца. Изучение сокращающегося сердца in vivo имеет важное значение для получения информации о структурных и функциональных изменениях в ответ на травмы. Тем не менее, получение высокоскоростных 4-мерных (4D, 3D пространственных + 1D временных) изображений сердца рыбки данио для оценки сердечной архитектуры и сократимости сердца остается сложной задачей. В этом контексте для преодоления этих технических ограничений используется собственный световой микроскоп (LSM) и специализированный вычислительный анализ. Эта стратегия, включающая построение системы LSM, ретроспективную синхронизацию, отслеживание отдельных клеток и управляемый пользователем анализ, позволяет исследовать микроструктуру и сократительную функцию по всему сердцу с одноклеточным разрешением у трансгенных личинок Tg(myl7:nucGFP). Кроме того, мы можем дополнительно использовать микроинъекции низкомолекулярных соединений для точного и контролируемого вызова сердечного поражения. В целом, эта система позволяет отслеживать физиологические и патофизиологические изменения, а также региональную механику на уровне отдельных клеток в процессе морфогенеза и регенерации сердца.
Рыбка данио-рерио (Danio rerio) является широко используемым модельным организмом для изучения сердечного развития, физиологии и восстановления благодаря своей оптической прозрачности, генетической податливости и регенеративной способности 1,2,3,4. При инфаркте миокарда, в то время как структурные и функциональные изменения влияют на выброс сердца и гемодинамику, технические ограничения продолжают препятствовать возможности исследовать динамический процесс во время регенерации сердца с высоким пространственно-временным разрешением. ....
Разрешение на проведение этого исследования было выдано Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Техасского университета в Далласе под номером протокола #20-07. Для настоящего исследования использовали12 трансгенных личинок данио-рерио Tg(myl7:nucGFP). Весь сбо.......
Текущий протокол состоит из трех основных этапов: подготовка рыбок данио и микроинъекция, визуализация светового листа и реконструкция 4D-изображения, а также отслеживание клеток и взаимодействие с виртуальной реальностью. Взрослым рыбкам данио-рерио было позволено спариваться, оплод.......
Интеграция модели рыбки данио с инженерными методами имеет огромный потенциал для исследования in vivo инфаркта миокарда, аритмий и врожденных пороков сердца. Используя свою оптическую прозрачность, регенеративную способность, а также генетическое и физиологическое сходство с чел?.......
Мы выражаем нашу благодарность доктору Кэролайн Бернс из Бостонской детской больницы за то, что она щедро поделилась трансгенными рыбками данио. Мы благодарим г-жу Элизабет Ибаньес за ее помощь в разведении рыбок данио-рерио в UT Dallas. Мы также ценим все конструктивные комментарии, предоставленные членами D-инкубатора в UT Dallas. Эта работа была поддержана NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) и UT Dallas STARS program (Y.D.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
RESOURCE | SOURCE/Reference | IDENTIFIER | |
Animal models | |||
Tg(myl7:nucGFP) transgenic zebrafish | Burns Lab in Boston Children's Hospital | ZDB-TGCONSTRCT-070117-49 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | The MathWorks Inc. | R2023a | |
LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
Python | The Python Software Foundation | 3.9.0 | |
Fiji-ImageJ | Schneider et al.18 | 1.54f | |
3DeeCellTracker | Chentao Wen et al.15 | v0.5.2 | |
Unity | Unity Software Inc. | 2020.3.2f1 | |
Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
3D Slicer | Andriy Fedorov et al.17 | 5.2.1 | |
ITK SNAP | Paul A Yushkevich et al.16 | 4 | |
Light-sheet system | |||
Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
4X Illumination objective | Nikon | MRH00045 | |
20X Detection objective | Olympus | 1-U2M585 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
Motorized XYZ stage | Thorlabs | PT3/M-Z8 | |
Two-axis tilt stage | Thorlabs | GN2/M | |
Rotation stepper motor | Pololu | 1474 | |
Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
473nm DPSS Laser | Laserglow | R471003GX | |
532nm DPSS laser | Laserglow | R531003FX | |
Microinjector and vacuum pump | |||
Microinjector | WPI | PV850 | |
Vacuum pump | Welch | 2522B-01 | |
Pre-Pulled Glass Pipettes | WPI | TIP10LT | |
Capillary tip for gel loading | Bio-Rad | 2239912 | |
Virtual reality hardware | |||
VR headset | Meta | Quest 2 | |
30mg/L PTU solution | |||
PTU | Sigma-Aldrich | P7629 | |
1X E3 working solution | - | - | |
1% Agarose | - | - | |
Low-melt agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
Deionized water | - | - | |
10g/L Tricaine stock solution | |||
Tricaine | Syndel | SYNC-M-GR-US02 | |
Deionized water | - | - | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
150mg/L Tricaine working solution | |||
10g/L Tricaine stock solution | - | - | |
Deionized water | - | - | |
60X E3 stock solution | |||
Sodium Chloride | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | NaCl | |
Potassium Chloride | - | KCL | |
Calcium Chloride Dihydrate | - | CaCL2 x 2H2O | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | - | MgSO4 x 7H2O | |
RO Water | - | - | |
1X E3 working solution | |||
60X E3 stock solution | Lab Animal Resource Center (LARC), The University of Texas at Dallas | - | |
RO Water | - | - | |
1% Methylene Blue (optional) | - | C16H18ClN3S |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved