دراسة مقارنة لمصفوفات الغشاء القاعدي لصيانة الخلايا الجذعية البشرية وتوليد الأعضاء المعوية

Summary

أصبحت المواد العضوية أدوات قيمة لنمذجة الأمراض. توجه المصفوفة خارج الخلية (ECM) مصير الخلية أثناء توليد الأعضاء ، ويمكن أن يؤدي استخدام نظام يشبه الأنسجة الأصلية إلى تحسين دقة النموذج. تقارن هذه الدراسة توليد العضويات المعوية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات في ECM المشتقة من والهلاميات المائية الخالية من xeno.

Abstract

تلعب المصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا مهما في سلوك الخلية وتطورها. المواد العضوية المتولدة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) هي في دائرة الضوء في العديد من مجالات البحث. ومع ذلك ، فإن عدم وجود إشارات فسيولوجية في مواد زراعة الخلايا الكلاسيكية يعيق تمايز iPSC الفعال. يوفر دمج ECM المتاح تجاريا في زراعة الخلايا الجذعية إشارات فيزيائية وكيميائية مفيدة لصيانة الخلايا. تتكون منتجات الغشاء القاعدي المشتقة تجاريا من من بروتينات ECM وعوامل النمو التي تدعم صيانة الخلايا. نظرا لأن ECM يحمل خصائص خاصة بالأنسجة يمكنها تعديل مصير الخلية ، يتم استخدام المصفوفات الخالية من xeno لتدفق الترجمة إلى الدراسات السريرية. في حين أن المصفوفات المتاحة تجاريا تستخدم على نطاق واسع في hiPSC والعمل العضوي ، لم يتم تقييم معادلة هذه المصفوفات بعد. هنا ، أجريت دراسة مقارنة لصيانة hiPSC وتوليد العضويات المعوية البشرية (hIO) في أربع مصفوفات مختلفة: Matrigel (Matrix 1-AB) ، Geltrex (Matrix 2-AB) ، Cultrex (Matrix 3-AB) ، و VitroGel (Matrix 4-XF). على الرغم من أن المستعمرات تفتقر إلى شكل دائري تماما ، إلا أنه كان هناك حد أدنى من التمايز التلقائي ، حيث كان أكثر من 85٪ من الخلايا تعبر عن علامة الخلايا الجذعية SSEA-4. أدت المصفوفة 4-XF إلى تشكيل كتل مستديرة ثلاثية الأبعاد. أيضا ، أدت زيادة تركيز العوامل التكميلية والنمو في الوسائط المستخدمة لصنع محلول هيدروجيل Matrix 4-XF إلى تحسين تعبير hiPSC ل SSEA-4 بمقدار 1.3 ضعف. أدى تمايز Matrix 2-AB - الحفاظ على hiPSC إلى عدد أقل من الإطلاقات الكروية خلال المرحلة المتوسطة / الخلفية مقارنة بالأغشية القاعدية الأخرى المشتقة من. بالمقارنة مع الآخرين ، تؤدي المصفوفة العضوية الخالية من xeno (Matrix 4-O3) إلى hIO أكبر وأكثر نضجا ، مما يشير إلى أنه يمكن تسخير الخصائص الفيزيائية للهلاميات المائية الخالية من xeno لتحسين توليد المواد العضوية. إجمالا ، تشير النتائج إلى أن الاختلافات في تكوين المصفوفات المختلفة تؤثر على مراحل تمايز IO. تعمل هذه الدراسة على زيادة الوعي حول الاختلافات في المصفوفات المتاحة تجاريا وتوفر دليلا لتحسين المصفوفة أثناء عمل iPSC و IO.

Introduction

المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي مكون ديناميكي ومتعدد الوظائف للأنسجة يلعب دورا مركزيا في تنظيم سلوك الخلية وتطورها. كشبكة معقدة ، فإنه يوفر الدعم الهيكلي ، والروابط اللاصقة للخلايا¹ ، وتخزين عوامل النمو والسيتوكينات التي تنظم إشارات الخلية. على سبيل المثال ، أثناء التئام الجروح ، يعمل ECM كسقالة للخلايا المهاجرة وكخزان لعوامل النمو المشاركة في إصلاح الأنسجة². وبالمثل ، يمكن أن يؤدي عدم التنظيم في ECM إلى زيادة في شدة الأمراض المختلفة مثل التليف والسرطان ^3,4. أثناء التطور الجنيني ، يوجه ECM تشكل الأنسجة. على سبيل المثال ، في تطور القلب ، تلعب مكونات ECM دورا في إنشا....

Protocol

1. صيانة hiPSC

تنبيه: تتم جميع الأعمال في خزانة السلامة البيولوجية (BSC) باتباع تقنيات التعقيم القياسية. يجب اتباع معايير السلامة OSHA للمختبرات ، بما في ذلك الاستخدام السليم لمعدات الحماية الشخصية مثل معاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية.

1. إعداد حصصا المصفوفا?.......

Discussion

يعد اختيار البيئة المكروية المثلى لعمل الخلايا الجذعية والأعضاء خطوة مبكرة محورية عند استخدام هذه المنصات لمجموعة واسعة من التطبيقات. تظهر نتائجنا التمثيلية أن Matrix 4-XFO3 ، إلى جانب تركيز أعلى من عوامل النمو ، يؤدي إلى عضويات أكبر ، مما يشير إلى أنه يمكن تسخير الخصائص الفيزيائية للهلاميات ا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K