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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

类器官已成为疾病建模的宝贵工具。细胞外基质 (ECM) 在类器官生成过程中指导细胞命运,使用类似于天然组织的系统可以提高模型的准确性。这项研究比较了动物源性 ECM 和无异种水凝胶中诱导多能干细胞衍生的人肠道类器官的产生。

Abstract

细胞外基质(ECM)在细胞行为和发育中起着关键作用。由人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 产生的类器官是许多研究领域的焦点。然而,经典细胞培养材料中缺乏生理线索阻碍了有效的iPSC分化。将市售的ECM掺入干细胞培养中,可提供有益于细胞维持的物理和化学线索。动物源性市售基底膜产品由支持细胞维持的 ECM 蛋白和生长因子组成。由于 ECM 具有可以调节细胞命运的组织特异性,因此无异种基质用于将翻译上级到临床研究。虽然市售基质广泛用于 hiPSC 和类器官工作,但这些基质的等效性尚未得到评估。在这里,进行了四种不同基质中hiPSC维持和人肠道类器官(hIO)生成的比较研究:Matrigel(Matrix 1-AB)、Geltrex(Matrix 2-AB)、Cultrex(Matrix 3-AB)和VitroGel(Matrix 4-XF)。尽管这些菌落缺乏完美的圆形形状,但自发分化极小,超过85%的细胞表达干细胞标记物SSEA-4。基质 4-XF 导致 3D 圆形团块的形成。此外,在用于制备 Matrix 4-XF 水凝胶溶液的培养基中增加补充剂和生长因子的浓度可将 SSEA-4 的 hiPSC 表达提高 1.3 倍。与其他动物源性基底膜相比,基质 2-AB 维持的 hiPSC 的分化导致中/后肠阶段的球状体释放减少。与其他基质相比,无异种有机体基质(基质 4-O3)导致更大、更成熟的 hIO,这表明可以利用无异种水凝胶的物理特性来优化类器官的生成。总而言之,结果表明,不同基质组成的变化会影响IO分化的阶段。这项研究提高了人们对商用基质差异的认识,并为 iPSC 和 IO 工作期间的基质优化提供了指导。

Introduction

细胞外基质 (ECM) 是组织的动态和多功能组成部分,在调节细胞行为和发育方面发挥着核心作用。作为一个复杂的网络,它提供结构支持、细胞粘附配体1 以及调节细胞信号传导的生长因子和细胞因子的储存。例如,在伤口愈合过程中,ECM 充当迁移细胞的支架和参与组织修复的生长因子的储存库2。同样,ECM 中的失调会导致各种疾病(如纤维化和癌症)的严重程度增加 3,4。在胚胎发育过程中,ECM指导组织形态发生。例如,在心脏的发育中,ECM 组件在创建心脏组织的正确结构和功能方面发挥作用5.十多年的研究表明,仅微环境的硬度6,7就可以控制干细胞谱系规格。因此,在体外细胞分化过程中,ECM通过提供分化信号来影响干细胞的命运也就不足为奇了。

类器官可以由诱导多能干细胞 (iPSC) 产生。从正确表征的 iPSC 系开始,需要成功生成类器官。然而,经典细胞培养材料中缺乏生理线索阻碍了有效的 iPSC 分化和类器官生成。此外,最近的研究强调了细胞外基质 (ECM) 组成、细胞与 ECM

Protocol

1. hiPSC维持

注意:所有工作均在生物安全柜 (BSC) 中按照标准无菌技术完成。必须遵守 OSHA 实验室安全标准,包括正确使用实验室外套、手套和护目镜等个人防护设备。

  1. 基质、等分试样和细胞培养基的制备
    1. 用于市售的动物源性基底膜(BMs;基质 1-AB、基质 2-AB、基质 3-AB),按照 表 1 中总结的制造商建议制备工作体积的等分试样,并将它.......

Representative Results

按照该方案,成功地利用市售的基底膜和无异种水凝胶系统来培养hiPSC细胞并将它们分化为hIO。这些实验的主要目的是系统地评估来自各种来源的基质对hiPSC和hIO工作的等效性。该协议的第一部分侧重于维持和表征健康的 iPSC 培养物,该培养物可产生有效的肠道类器官。描述了用动物源性基质基质 Matrix 1-AB、Matrix 2-AB 和 Matrix 3-AB 包被培养皿的过程,并与无异种水凝胶系统 Matrix 4-XF 进行了比较。

.......

Discussion

在将这些平台用于广泛的应用时,为干细胞和类器官工作选择最佳微环境是关键的早期步骤。我们的代表性结果表明,基质 4-XFO3 与更高浓度的生长因子相结合,可产生更大的类器官,这表明可以利用无异种水凝胶的物理特性来优化使用这些系统的类器官生成。先前已经表明,细胞外基质 (ECM) 的独特特性与器官12 内细胞的身份密切相关。由于细胞通过整合素和其他受体感知外.......

Acknowledgements

作者感谢 Christina Pacak、Silveli Susuki-Hatano 和 Russell D'Souza 博士之前关于开始 hiPSC 和类器官工作的培训和一般建议。他们感谢 Chelsey Simmons 博士在使用水凝胶系统进行 体外 细胞培养工作方面的指导。此外,作者还要感谢 STEMCELL Technologies 的 Christine Rodriguez 博士和 Thomas Allison 博士对 hiPSC 培养的指导。作者还感谢TheWell Bioscience支付了出版费用。

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)Falcon353504
37 °C water bathVWR
96-well plate Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Anti-adherence Rinsing SolutioSTEMCELL Technologies7010
Biological safety cabinet (BSC)Labconco Logic
Brightfield MicroscopeEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)ThermoScientific75002441
Conical tubes, 15 mL, sterileThermo Fisher Scientific339650
Conical tubes, 50 mL, sterileThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Type 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth FactorGibco A14133-02
GlutaMAX SupplementThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)Luminex0500-3115
HEPES buffer solutionThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)Thermo Scientific 51033775
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV freeCorning 356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-freeCorning 354263
mTeSR Plus MediumSTEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plateThermo Scientific144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Mouse Anti-human FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Serological pipettes (10 mL) Fisher Scientific13-678-11E
Serological pipettes (5 mL) Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth MediumSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Intestinal Organoid KitSTEMCELL Technologies5140
Vitrogel Hydrogel MatrixTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K

References

  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010....

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