Vergelijkende studie van basaalmembraanmatrices voor het onderhoud van menselijke stamcellen en het genereren van darmorganoïden

Summary

Organoïden zijn waardevolle hulpmiddelen geworden voor het modelleren van ziekten. De extracellulaire matrix (ECM) stuurt het lot van cellen tijdens het genereren van organoïden, en het gebruik van een systeem dat lijkt op het natuurlijke weefsel kan de nauwkeurigheid van het model verbeteren. Deze studie vergelijkt de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide menselijke darmorganoïden in dierlijk ECM en xeno-vrije hydrogels.

Abstract

Extracellulaire matrix (ECM) speelt een cruciale rol in het gedrag en de ontwikkeling van cellen. Organoïden gegenereerd uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) staan in de schijnwerpers van veel onderzoeksgebieden. Het gebrek aan fysiologische signalen in klassieke celkweekmaterialen belemmert echter een efficiënte iPSC-differentiatie. Het opnemen van in de handel verkrijgbare ECM in stamcelcultuur biedt fysische en chemische aanwijzingen die gunstig zijn voor celonderhoud. In de handel verkrijgbare basale membraanproducten van dierlijke oorsprong zijn samengesteld uit ECM-eiwitten en groeifactoren die het celonderhoud ondersteunen. Omdat de ECM weefselspecifieke eigenschappen heeft die het lot van cellen kunnen moduleren, worden xenovrije matrices gebruikt om de vertaling naar klinische studies te stroomlijnen. Hoewel in de handel verkrijgbare matrices veel worden gebruikt in hiPSC- en organoïdewerk, is de equivalentie van deze matrices nog niet geëvalueerd. Hier werd een vergelijkende studie uitgevoerd van hiPSC-onderhoud en de aanmaak van menselijke darmorganoïden (hIO) in vier verschillende matrices: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) en VitroGel (Matrix 4-XF). Hoewel de kolonies geen perfect ronde vorm hadden, was er minimale spontane differentiatie, waarbij meer dan 85% van de cellen de stamcelmarker SSEA-4 tot expressie bracht. Matrix 4-XF leidde tot de vorming van 3D ronde klonten. Ook verbeterde het verhogen van de concentratie van supplementen en groeifactoren in de media die werden gebruikt om de Matrix 4-XF-hydrogeloplossing te maken, de hiPSC-expressie van SSEA-4 met een factor 1,3. Differentiatie van Matrix 2-AB-onderhouden hiPSC leidde tot minder sferoïde releases tijdens het midden-/achterdarmstadium in vergelijking met de andere van dieren afkomstige basale membranen. In vergelijking met andere leidt de xenovrije organoïdematrix (Matrix 4-O3) tot grotere en rijpere hIO, wat suggereert dat de fysische eigenschappen van xenovrije hydrogels kunnen worden benut om de vorming van organoïden te optimaliseren. Al met al suggereren de resultaten dat variaties in de samenstelling van verschillende matrices de stadia van IO-differentiatie beïnvloeden. Deze studie vergroot het bewustzijn over de verschillen in commercieel verkrijgbare matrices en biedt een leidraad voor matrixoptimalisatie tijdens iPSC- en IO-werk.

Introduction

De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamisch en multifunctioneel onderdeel van weefsels dat een centrale rol speelt bij het reguleren van het gedrag en de ontwikkeling van cellen. Als een complex netwerk biedt het structurele ondersteuning, celadhesieve liganden¹ en opslag van groeifactoren en cytokinen die de celsignalering reguleren. Tijdens wondgenezing dient de ECM bijvoorbeeld als een steiger voor migrerende cellen en als een reservoir van groeifactoren die betrokken zijn bij weefselherstel². Evenzo kan ontregeling in de ECM leiden tot een toename van de ernst van verschillende ziekten zoals fibrose en kanker

Protocol

1. hiPSC onderhoud

LET OP: Al het werk wordt gedaan in een Biosafety Cabinet (BSC) volgens standaard aseptische technieken. Moet voldoen aan de OSHA-veiligheidsnormen voor laboratoria, inclusief het juiste gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen zoals laboratoriumjassen, handschoenen en veiligheidsbrillen.

1. Bereiding van matrices, aliquots en celkweekmedia
   1. Voor in de handel verkrijgbare, van dieren afkomstige basale membranen (BM's; Matrix 1-AB, Matrix 2-.......

Discussion

Het selecteren van de optimale microomgeving voor stamcel- en organoïdewerk is een cruciale eerste stap bij het gebruik van deze platforms voor een breed scala aan toepassingen. Onze representatieve resultaten tonen aan dat Matrix 4-XFO3, in combinatie met een hogere concentratie van groeifactoren, leidt tot grotere organoïden, wat suggereert dat de fysische eigenschappen van xenovrije hydrogels kunnen worden benut om de vorming van organoïden te optimaliseren met behulp van deze systemen. Eerder is aangetoond dat de .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K