Etude comparative des matrices de membrane basale pour l’entretien des cellules souches humaines et la génération d’organoïdes intestinaux

Summary

Les organoïdes sont devenus des outils précieux pour la modélisation des maladies. La matrice extracellulaire (MEC) guide le destin cellulaire pendant la génération d’organoïdes, et l’utilisation d’un système qui ressemble au tissu natif peut améliorer la précision du modèle. Cette étude compare la génération d’organoïdes intestinaux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des ECM d’origine animale et des hydrogels sans xéno.

Abstract

La matrice extracellulaire (MEC) joue un rôle essentiel dans le comportement et le développement cellulaires. Les organoïdes générés à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont sous les feux de la rampe dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, l’absence de repères physiologiques dans les matériaux de culture cellulaire classiques entrave la différenciation efficace des iPSC. L’incorporation de la MEC disponible dans le commerce dans la culture de cellules souches fournit des indices physiques et chimiques bénéfiques pour la maintenance cellulaire. Les produits de membrane basale d’origine animale disponibles dans le commerce sont composés de protéines ECM et de facteurs de croissance qui soutiennent le maintien des cellules. Étant donné que l’ECM possède des propriétés spécifiques aux tissus qui peuvent moduler le destin cellulaire, des matrices sans xéno sont utilisées pour diffuser la traduction vers les études cliniques. Bien que les matrices disponibles dans le commerce soient largement utilisées dans les travaux sur les hiPSC et les organoïdes, l’équivalence de ces matrices n’a pas encore été évaluée. Ici, une étude comparative de l’entretien des hiPSC et de la génération d’organoïdes intestinaux humains (hIO) dans quatre matrices différentes : Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) et VitroGel (Matrix 4-XF) a été menée. Bien que les colonies n’aient pas une forme parfaitement ronde, il y avait une différenciation spontanée minimale, avec plus de 85% des cellules exprimant le marqueur de cellules souches SSEA-4. La matrice 4-XF a conduit à la formation de touffes rondes en 3D. De plus, l’augmentation de la concentration du supplément et des facteurs de croissance dans les milieux utilisés pour fabriquer la solution d’hydrogel Matrix 4-XF a amélioré l’expression de SSEA-4 par 1,3. La différenciation de l’hiPSC maintenue par la matrice 2-AB a entraîné moins de libérations de sphéroïdes au cours du stade de l’intestin moyen/postérieur par rapport aux autres membranes basales d’origine animale. Par rapport à d’autres, la matrice d’organoïdes sans xéno (matrice 4-O3) conduit à des hIO plus grands et plus matures, ce qui suggère que les propriétés physiques des hydrogels sans xénogrammes peuvent être exploitées pour optimiser la génération d’organoïdes. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que les variations dans la composition des différentes matrices affectent les étapes de différenciation des IO. Cette étude sensibilise aux différences entre les matrices disponibles dans le commerce et fournit un guide pour l’optimisation des matrices lors des travaux iPSC et IO.

Introduction

La matrice extracellulaire (MEC) est un composant dynamique et multifonctionnel des tissus qui joue un rôle central dans la régulation du comportement et du développement cellulaires. En tant que réseau complexe, il fournit un support structurel, des ligands adhésifs cellulaires¹ et le stockage de facteurs de croissance et de cytokines qui régulent la signalisation cellulaire. Par exemple, lors de la cicatrisation des plaies, l’ECM sert d’échafaudage pour les cellules migrantes et de réservoir de facteurs de croissance impliqués dans la réparation tissulaire². De même, la dérégulation de l’ECM peut entraîner une augmenta....

Protocol

1. Maintenance des hiPSC

ATTENTION : Tous les travaux sont effectués dans une enceinte de biosécurité (BSC) selon des techniques aseptiques standard. Doit suivre les normes de sécurité de l’OSHA pour les laboratoires, y compris l’utilisation appropriée d’équipements de protection individuelle tels que des blouses de laboratoire, des gants et des lunettes de protection.

1. Préparation de matrices, d’aliquotes et de milieux de culture cellulaire
   1. Pou.......

Discussion

La sélection du microenvironnement optimal pour le travail sur les cellules souches et les organoïdes est une première étape cruciale lors de l’utilisation de ces plateformes pour un large éventail d’applications. Nos résultats représentatifs montrent que la matrice 4-XFO3, en combinaison avec une concentration plus élevée de facteurs de croissance, conduit à des organoïdes plus grands, ce qui suggère que les propriétés physiques des hydrogels sans xénogrammes peuvent être exploitées pour optimiser l.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K