מחקר השוואתי של מטריצות קרום מרתף לתחזוקת תאי גזע אנושיים ויצירת אורגנואידים במעי

Summary

אורגנואידים הפכו לכלים רבי ערך למידול מחלות. המטריצה החוץ תאית (ECM) מנחה את גורל התא במהלך יצירת אורגנואידים, ושימוש במערכת הדומה לרקמה הטבעית יכול לשפר את דיוק המודל. מחקר זה משווה את הדור של אורגנואידי מעיים אנושיים המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע אנושיים ב- ECM שמקורו בבעלי חיים ובהידרוג'לים נטולי קסנו.

Abstract

מטריצה חוץ-תאית (ECM) ממלאת תפקיד קריטי בהתנהגות התא ובהתפתחותו. אורגנואידים המופקים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) נמצאים באור הזרקורים של תחומי מחקר רבים. עם זאת, היעדר רמזים פיזיולוגיים בחומרים קלאסיים של תרביות תאים מעכב התמיינות יעילה של iPSC. שילוב ECM זמין מסחרית בתרבית תאי גזע מספק רמזים פיזיים וכימיים מועילים לתחזוקת התא. מוצרי ממברנות מרתף מסחריות שמקורם בבעלי חיים מורכבים מחלבוני ECM וגורמי גדילה התומכים בתחזוקת התא. מכיוון של-ECM יש תכונות ספציפיות לרקמות שיכולות לווסת את גורל התא, משתמשים במטריצות נטולות קסנו כדי להזרים תרגום למחקרים קליניים. בעוד שמטריצות זמינות מסחרית נמצאות בשימוש נרחב בעבודות hiPSC ואורגנואידים, השקילות של מטריצות אלה עדיין לא הוערכה. כאן נערך מחקר השוואתי של תחזוקת hiPSC ויצירת אורגנואידים במעיים אנושיים (hIO) בארבע מטריצות שונות: מטריג'ל (מטריקס 1-AB), גלטרקס (מטריקס 2-AB), קולטרקס (מטריקס 3-AB) וויטרוג'ל (מטריקס 4-XF). למרות שהמושבות חסרו צורה עגולה מושלמת, הייתה התמיינות ספונטנית מינימלית, כאשר מעל 85% מהתאים ביטאו את סמן תאי הגזע SSEA-4. מטריקס 4-XF הוביל להיווצרות גושים עגולים תלת ממדיים. כמו כן, הגדלת ריכוז תוספי התזונה וגורמי הגדילה במדיה המשמשת לייצור תמיסת ההידרוג'ל Matrix 4-XF שיפרה את ביטוי hiPSC של SSEA-4 פי 1.3. התמיינות של hiPSC מתוחזק על ידי מטריקס 2-AB הובילה לפחות שחרור ספרואידים בשלב האמצע/בטן אחורית בהשוואה לקרומי מרתף אחרים שמקורם בבעלי חיים. בהשוואה לאחרים, מטריצת אורגנואידים נטולי קסנו (Matrix 4-O3) מובילה ל-hIO גדול ובשל יותר, מה שמרמז על כך שניתן לרתום את התכונות הפיזיקליות של הידרוג'לים נטולי קסנו כדי לייעל את ייצור האורגנואידים. בסך הכל, התוצאות מצביעות על כך ששינויים בהרכב של מטריצות שונות משפיעים על שלבי התמיינות IO. מחקר זה מעלה את המודעות להבדלים במטריצות הזמינות מסחרית ומספק מדריך לאופטימיזציה של מטריצה במהלך עבודת iPSC וקלט/פלט.

Introduction

המטריצה החוץ תאית (ECM) היא מרכיב דינמי ורב-תכליתי של רקמות הממלא תפקיד מרכזי בוויסות התנהגות התא והתפתחותו. כרשת מורכבת, היא מספקת תמיכה מבנית, ליגנדות דבק תאים¹, ואחסון של גורמי גדילה וציטוקינים המווסתים את האיתות התאי. לדוגמה, במהלך ריפוי פצעים, ECM משמש כפיגום לתאים נודדים וכמאגר של גורמי גדילה המעורבים בתיקון רקמות². באופן דומה, חוסר ויסות ב- ECM יכול להוביל לעלייה בחומרת מחלות שונות כגון פיברוזיס וסרטן ^3,4. במהלך ההתפתחות העוברית, ה- ECM מנחה מורפוגנזה של רקמות. לדוגמה, בפיתוח הלב, רכיבי ECM ממלאים תפקיד ביצירת הארכיטקטורה והתפקוד הנכונים של רקמת הלב

Protocol

1. תחזוקת hiPSC

זהירות: כל העבודה נעשית בארון בטיחות ביולוגית (BSC) בהתאם לטכניקות אספטיות סטנדרטיות. חייב לעמוד בתקני הבטיחות של OSHA למעבדות, כולל שימוש נאות בציוד מגן אישי כגון מעילי מעבדה, כפפות ומשקפי מגן.

1. הכנת מטריצות, aliquots ומדיה תרבית התא
   1. עבור ממברנות מרתף ?.......

Discussion

בחירת המיקרו-סביבה האופטימלית לעבודה של תאי גזע ואורגנואידים היא צעד מוקדם מכריע בעת שימוש בפלטפורמות אלה למגוון רחב של יישומים. התוצאות המייצגות שלנו מראות כי מטריקס 4-XFO3, בשילוב עם ריכוז גבוה יותר של גורמי גדילה, מוביל לאורגנואידים גדולים יותר, דבר המצביע על כך שניתן לרתום את התכונות הפי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K