मानव स्टेम सेल रखरखाव और आंतों के ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के लिए तहखाने-झिल्ली मैट्रिक्स का तुलनात्मक अध्ययन

Summary

ऑर्गेनोइड रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान उपकरण बन गए हैं। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ऑर्गेनॉइड पीढ़ी के दौरान सेल भाग्य का मार्गदर्शन करता है, और देशी ऊतक जैसा दिखने वाली प्रणाली का उपयोग करके मॉडल सटीकता में सुधार कर सकता है। यह अध्ययन पशु-व्युत्पन्न ईसीएम और ज़ेनो-मुक्त हाइड्रोगेल में प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न मानव आंतों के ऑर्गेनोइड की पीढ़ी की तुलना करता है।

Abstract

एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) सेल व्यवहार और विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) से उत्पन्न ऑर्गेनोइड कई शोध क्षेत्रों की सुर्खियों में हैं। हालांकि, शास्त्रीय सेल संस्कृति सामग्री में शारीरिक संकेतों की कमी कुशल आईपीएससी भेदभाव में बाधा डालती है। स्टेम सेल कल्चर में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईसीएम को शामिल करने से सेल रखरखाव के लिए फायदेमंद भौतिक और रासायनिक संकेत मिलते हैं। पशु-व्युत्पन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली उत्पाद ईसीएम प्रोटीन और विकास कारकों से बने होते हैं जो सेल रखरखाव का समर्थन करते हैं। चूंकि ईसीएम ऊतक-विशिष्ट गुण रखता है जो सेल भाग्य को संशोधित कर सकता है, ज़ेनो-मुक्त मैट्रिसेस का उपयोग नैदानिक अध्ययनों में अनुवाद को स्ट्रीम करने के लिए किया जाता है। जबकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैट्रिसेस का व्यापक रूप से एचआईपीएससी और ऑर्गेनॉइड कार्य में उपयोग किया जाता है, इन मैट्रिक्स की समानता का मूल्यांकन अभी तक नहीं किया गया है। यहां, चार अलग-अलग मैट्रिक्स में एचआईपीएससी रखरखाव और मानव आंतों के ऑर्गेनोइड (एचआईओ) पीढ़ी का तुलनात्मक अध्ययन: मैट्रिगेल (मैट्रिक्स 1-एबी), गेल्ट्रेक्स (मैट्रिक्स 2-एबी), कल्ट्रेक्स (मैट्रिक्स 3-एबी), और विट्रोगेल (मैट्रिक्स 4-एक्सएफ) आयोजित किया गया था। हालांकि कालोनियों एक पूरी तरह से गोल आकार का अभाव था, वहाँ कम से कम सहज भेदभाव था, कोशिकाओं के 85% से अधिक स्टेम सेल मार्कर SSEA-4 व्यक्त के साथ. मैट्रिक्स 4-एक्सएफ ने 3 डी गोल गुच्छों के गठन का नेतृत्व किया। इसके अलावा, मैट्रिक्स 4-एक्सएफ हाइड्रोगेल समाधान बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया में पूरक और विकास कारकों की एकाग्रता में वृद्धि ने एसएसईए -4 की एचआईपीएससी अभिव्यक्ति में 1.3 गुना सुधार किया। मैट्रिक्स 2-एबी के भेदभाव बनाए रखा hiPSC अन्य पशु-व्युत्पन्न तहखाने झिल्ली की तुलना में मध्य / हिंदगट चरण के दौरान कम गोलाकार रिलीज के लिए नेतृत्व किया. दूसरों की तुलना में, ज़ेनो-मुक्त ऑर्गेनॉइड मैट्रिक्स (मैट्रिक्स 4-ओ 3) बड़े और अधिक परिपक्व एचआईओ की ओर जाता है, यह सुझाव देता है कि ऑर्गेनॉइड पीढ़ी को अनुकूलित करने के लिए ज़ेनो-मुक्त हाइड्रोगेल के भौतिक गुणों का उपयोग किया जा सकता है। कुल मिलाकर, परिणाम बताते हैं कि विभिन्न मैट्रिक्स की संरचना में भिन्नता आईओ भेदभाव के चरणों को प्रभावित करती है। यह अध्ययन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मैट्रिक्स में अंतर के बारे में जागरूकता बढ़ाता है और आईपीएससी और आईओ कार्य के दौरान मैट्रिक्स अनुकूलन के लिए एक गाइड प्रदान करता है।

Introduction

बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतकों का एक गतिशील और बहुक्रियाशील घटक है जो सेल व्यवहार और विकास को विनियमित करने में केंद्रीय भूमिका निभाता है। एक जटिल नेटवर्क के रूप में, यह संरचनात्मक समर्थन, सेल चिपकने वाला लिगैंड¹, और विकास कारकों और साइटोकिन्स का भंडारण प्रदान करता है जो सेल सिग्नलिंग को नियंत्रित करते हैं। उदाहरण के लिए, घाव भरने के दौरान, ईसीएम माइग्रेट कोशिकाओं के लिए एक मचान के रूप में और ऊतक^{की मरम्मत 2} में शामिल विकास कारकों के जलाशय के रूप में कार्य करता है। इसी तरह, ईसीएम में डिसरेग्यूलेशन से फाइब्रोसिस और कैंसर जैसे विभिन्न रोगों की गंभीरता में वृद्धि हो सकती ^है

Protocol

1. hiPSC रखरखाव

चेतावनी: सभी काम मानक सड़न रोकनेवाला तकनीकों के बाद एक जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किया जाता है। प्रयोगशालाओं के लिए OSHA सुरक्षा मानकों का पालन करना चाहिए, जिसमें व्यक्ति?.......

Discussion

स्टेम सेल और ऑर्गेनॉइड कार्य के लिए इष्टतम माइक्रोएन्वायरमेंट का चयन करना अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इन प्लेटफार्मों का उपयोग करते समय एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है। हमारे प्रतिनिध.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K