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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Gli organoidi sono diventati strumenti preziosi per la modellazione delle malattie. La matrice extracellulare (ECM) guida il destino cellulare durante la generazione degli organoidi e l'utilizzo di un sistema che assomiglia al tessuto nativo può migliorare l'accuratezza del modello. Questo studio confronta la generazione di organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte in ECM di origine animale e idrogel privi di xeno.

Abstract

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo fondamentale nel comportamento e nello sviluppo cellulare. Gli organoidi generati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono sotto i riflettori di molte aree di ricerca. Tuttavia, la mancanza di segnali fisiologici nei materiali classici per colture cellulari ostacola un'efficiente differenziazione delle iPSC. L'integrazione della MEC disponibile in commercio nella coltura di cellule staminali fornisce spunti fisici e chimici utili per il mantenimento delle cellule. I prodotti di membrana basale di origine animale disponibili in commercio sono composti da proteine ECM e fattori di crescita che supportano il mantenimento cellulare. Poiché la ECM possiede proprietà tessuto-specifiche in grado di modulare il destino cellulare, le matrici prive di xeno vengono utilizzate per accelerare la traduzione verso gli studi clinici. Sebbene le matrici disponibili in commercio siano ampiamente utilizzate nel lavoro su hiPSC e organoidi, l'equivalenza di queste matrici non è stata ancora valutata. Qui, è stato condotto uno studio comparativo del mantenimento dell'hiPSC e della generazione di organoidi intestinali umani (hIO) in quattro diverse matrici: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Sebbene le colonie mancassero di una forma perfettamente rotonda, c'era una differenziazione spontanea minima, con oltre l'85% delle cellule che esprimevano il marcatore delle cellule staminali SSEA-4. La matrice 4-XF ha portato alla formazione di grumi rotondi 3D. Inoltre, l'aumento della concentrazione di integratori e fattori di crescita nei terreni utilizzati per produrre la soluzione di idrogel Matrix 4-XF ha migliorato l'espressione di SSEA-4 da parte di hiPSC di 1,3 volte. La differenziazione della hiPSC mantenuta con Matrix 2-AB ha portato a un minor numero di rilasci di sferoidi durante lo stadio medio/posteriore dell'intestino rispetto alle altre membrane basali di origine animale. Rispetto ad altre, la matrice di organoidi xeno-free (Matrix 4-O3) porta a hIO più grandi e più mature, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel xeno-free possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi. Nel complesso, i risultati suggeriscono che le variazioni nella composizione di diverse matrici influenzano le fasi di differenziazione dell'IO. Questo studio aumenta la consapevolezza sulle differenze nelle matrici disponibili in commercio e fornisce una guida per l'ottimizzazione delle matrici durante il lavoro iPSC e IO.

Introduction

La matrice extracellulare (ECM) è un componente dinamico e multifunzionale dei tessuti che svolge un ruolo centrale nella regolazione del comportamento e dello sviluppo cellulare. Essendo una rete complessa, fornisce supporto strutturale, ligandi adesivi cellulari1 e immagazzinamento di fattori di crescita e citochine che regolano la segnalazione cellulare. Ad esempio, durante la guarigione delle ferite, la MEC funge da impalcatura per le cellule in migrazione e da serbatoio di fattori di crescita coinvolti nella riparazione dei tessuti2. Allo stesso modo, la disregolazione nella MEC può portare ad un aumento della gravi....

Protocol

1. Manutenzione hiPSC

ATTENZIONE: Tutto il lavoro viene svolto in una cabina di biosicurezza (BSC) seguendo tecniche asettiche standard. Deve seguire gli standard di sicurezza OSHA per i laboratori, incluso l'uso corretto di dispositivi di protezione individuale come camici da laboratorio, guanti e occhiali.

  1. Preparazione di matrici, aliquote e terreni di coltura cellulare
    1. Per membrane basali di derivazione animale (BMs; Matrice 1-AB, Matrice 2-AB, Matrice 3-AB.......

Representative Results

Seguendo questo protocollo, le membrane basali disponibili in commercio e un sistema di idrogel privo di xeno sono stati utilizzati con successo per coltivare cellule hiPSC e differenziarle in hIO. L'obiettivo principale di questi esperimenti era quello di valutare sistematicamente l'equivalenza di matrici provenienti da varie fonti per il lavoro su hiPSC e hIO. La prima sezione di questo protocollo si è concentrata sul mantenimento e la caratterizzazione di una coltura sana di iPSC che produca un'efficiente generazione.......

Discussion

La selezione del microambiente ottimale per il lavoro con cellule staminali e organoidi è un primo passo fondamentale quando si utilizzano queste piattaforme per un'ampia gamma di applicazioni. I nostri risultati rappresentativi mostrano che la matrice 4-XFO3, in combinazione con una maggiore concentrazione di fattori di crescita, porta a organoidi più grandi, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel privi di xeno possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi utilizzando questi sistemi........

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la formazione precedente e le raccomandazioni generali riguardanti l'inizio del lavoro su hiPSC e organoidi da parte dei dottori Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D'Souza. Ringraziano la dottoressa Chelsey Simmons per la sua guida nell'utilizzo dei sistemi di idrogel per il lavoro di coltura cellulare in vitro . Inoltre, gli autori desiderano ringraziare i dottori Christine Rodriguez e Thomas Allison di STEMCELL Technologies per la loro guida sulla coltura hiPSC. Gli autori ringraziano anche TheWell Bioscience per aver coperto i costi di pubblicazione.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)Falcon353504
37 °C water bathVWR
96-well plate Fisher ScientificFB012931
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
Anti-adherence Rinsing SolutioSTEMCELL Technologies7010
Biological safety cabinet (BSC)Labconco Logic
Brightfield MicroscopeEcho RebelREB-01-E2
BXS0116ATCCACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)ThermoScientific75002441
Conical tubes, 15 mL, sterileThermo Fisher Scientific339650
Conical tubes, 50 mL, sterileThermo Fisher Scientific339652
Cultrex RGF BME, Type 2Bio-techne3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME Bio-techne3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)Thermo Fisher Scientific14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth FactorGibco A14133-02
GlutaMAX SupplementThermo Fischer Scientific35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)Luminex0500-3115
HEPES buffer solutionThermo Fischer Scientific15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)Thermo Scientific 51033775
JMP SoftwareSAS InstituteJMP 16
MATLABMathWorks, IncR2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV freeCorning 356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-freeCorning 354263
mTeSR Plus MediumSTEMCELL Technologies100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plateThermo Scientific144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)BD Pharmingen566841
PE Mouse Anti-human CDX2 BD Pharmingen563428
PE Mouse Anti-human FOXA2BD Pharmingen561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4 BD Pharmingen561565
ReLeSRSTEMCELL5872
SCTi003-ASTEMCELL Technologies200-0510
Serological pipettes (10 mL) Fisher Scientific13-678-11E
Serological pipettes (5 mL) Fisher Scientific13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth MediumSTEMCELL Technologies5145
STEMdiff Intestinal Organoid KitSTEMCELL Technologies5140
Vitrogel Hydrogel MatrixTheWell BioscienceVHM01
VitroGel ORGANOID Discovery KitTheWell BioscienceVHM04-K

References

  1. Hynes, R. O. Integrins: Bidirectional, allosteric signaling machines. Cell. 110 (6), 673-687 (2002).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123, 4195-4200 (2010....

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