ヒト幹細胞維持と腸管オルガノイド生成のための基底膜マトリックスの比較研究

Summary

オルガノイドは、疾患モデリングのための貴重なツールとなっています。細胞外マトリックス(ECM)は、オルガノイド生成中の細胞運命を導き、天然組織に似たシステムを使用することで、モデルの精度を向上させることができます。この研究では、動物由来のECMとゼノフリーのハイドロゲルにおける人工多能性幹細胞由来ヒト腸オルガノイドの生成を比較しています。

Abstract

細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の挙動と発生において重要な役割を果たします。ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から作製したオルガノイドは、多くの研究分野で注目されています。しかし、従来の細胞培養材料には生理的な手がかりがないため、効率的なiPS細胞の分化が妨げられています。市販のECMを幹細胞培養に組み込むと、細胞の維持に有益な物理的および化学的手がかりが得られます。動物由来の市販基底膜製品は、ECMタンパク質と細胞の維持をサポートする成長因子で構成されています。ECMは細胞の運命を調節できる組織特異的な特性を保持しているため、ゼノフリーマトリックスを使用して翻訳を臨床研究に流します。市販のマトリックスは、hiPSCやオルガノイドの研究に広く使用されていますが、これらのマトリックスの同等性はまだ評価されていません。本研究では、マトリゲル(Matrix 1-AB)、Geltrex(マトリックス2-AB)、Cultrex(マトリックス3-AB)、VitroGel(マトリックス4-XF)の4つの異なるマトリックスにおけるヒトヒト腸管オルガノイド(hIO)の産生について比較研究を行いました。コロニーは完全な円形を欠いていましたが、自発的な分化は最小限であり、細胞の85%以上が幹細胞マーカーSSEA-4を発現していました。マトリックス4-XFは、3Dの丸い塊の形成につながりました。また、Matrix 4-XFハイドロゲル溶液の調製に用いる培地中のサプリメントおよび成長因子の濃度を上げると、SSEA-4のhiPSC発現が1.3倍改善しました。マトリックス2-AB維持型ヒトPSCの分化により、他の動物由来の基底膜と比較して、中腸/後腸期のスフェロイド放出が少なくなりました。他のものと比較して、ゼノフリーオルガノイドマトリックス(Matrix 4-O3)は、より大きく、より成熟したhIOをもたらし、ゼノフリーハイドロゲルの物理的特性を利用してオルガノイド生成を最適化できることを示唆しています。全体として、この結果は、異なるマトリックスの組成の変動がIO分化の段階に影響を与えることを示唆しています。この研究は、市販の行列の違いについての認識を高め、iPSCおよびIO作業中の行列最適化のガイドを提供します。

Introduction

細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の挙動と発生の調節に中心的な役割を果たす組織の動的で多機能な構成要素です。複雑なネットワークとして、構造的な支持体、細胞接着性リガンド¹、細胞シグナル伝達を調節する成長因子やサイトカインの貯蔵を提供します。例えば、創傷治癒中、ECMは移動する細胞の足場として、また組織修復に関与する成長因子の貯蔵庫として機能します²。同様に、ECMの調節不全は、線維症や癌などのさまざまな疾患の重症度の増加につながる可能性があります^3,4。胚発生中、ECMは組織の形態形成を導きます。例えば、心臓の発達において、ECMコンポーネントは、心臓組織の正しい構造および機能を作り出す役割を果たす⁵。10年以上にわたる研究により、微小^環境の硬さだけでも^6,7が幹細胞の系統の仕様を制御できることが示されています。したがって、in vitroでの細胞分化中に、ECMが分化のシグナルを提供することで幹細胞の運命に影響を与えることは驚くべきことではありません。

オルガノイドは、人工多能性幹....

Protocol

1. hiPSCのメンテナンス

注意:すべての作業は、標準的な無菌技術に従ってバイオセーフティキャビネット(BSC)で行われます。白衣、手袋、ゴーグルなどの個人用保護具の適切な使用を含む、研究所のOSHA安全基準に従う必要があります。

1. マトリックス、アリコート、細胞培養培地の調製
   1. 市販の動物由来基底膜(BM;Matrix 1-AB, Matrix 2-AB, Matrix 3-AB)は、

Discussion

幹細胞およびオルガノイドの作業に最適な微小環境を選択することは、これらのプラットフォームを幅広いアプリケーションに使用する際の極めて重要な初期ステップです。私たちの代表的な結果は、マトリックス4-XFO3が高濃度の成長因子と組み合わさってより大きなオルガノイドにつながることを示しており、ゼノフリーハイドロゲルの物理的特性を利用して、これらのシステムを使用し?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K