Sammenlignende studie av basalmembranmatriser for vedlikehold av humane stamceller og generering av tarmorganoider

Summary

Organoider har blitt verdifulle verktøy for sykdomsmodellering. Den ekstracellulære matrisen (ECM) styrer celleskjebnen under organoidgenerering, og bruk av et system som ligner det opprinnelige vevet kan forbedre modellnøyaktigheten. Denne studien sammenligner genereringen av induserte pluripotente stamceller-avledede humane tarmorganoider i dyreavledede ECM og xeno-frie hydrogeler.

Abstract

Ekstracellulær matrise (ECM) spiller en kritisk rolle i celleatferd og utvikling. Organoider generert fra humant induserte pluripotente stamceller (hiPSC) er i søkelyset på mange forskningsområder. Mangelen på fysiologiske signaler i klassiske cellekulturmaterialer hindrer imidlertid effektiv iPSC-differensiering. Inkorporering av kommersielt tilgjengelig ECM i stamcellekultur gir fysiske og kjemiske signaler som er gunstige for cellevedlikehold. Animalske kommersielt tilgjengelige basalmembranprodukter er sammensatt av ECM-proteiner og vekstfaktorer som støtter cellevedlikehold. Siden ECM har vevsspesifikke egenskaper som kan modulere celleskjebne, brukes xenofrie matriser for å streame opp translasjon til kliniske studier. Mens kommersielt tilgjengelige matriser er mye brukt i hiPSC og organoidarbeid, er ekvivalensen til disse matrisene ikke evaluert ennå. Her ble det utført en komparativ studie av hiPSC-vedlikehold og generering av humane tarmorganoider (hIO) i fire forskjellige matriser: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) og VitroGel (Matrix 4-XF). Selv om koloniene manglet en perfekt rund form, var det minimal spontan differensiering, med over 85 % av cellene som uttrykte stamcellemarkøren SSEA-4. Matrix 4-XF førte til dannelsen av 3D-runde klumper. Å øke konsentrasjonen av kosttilskudd og vekstfaktorer i mediet som ble brukt til å lage Matrix 4-XF-hydrogelløsningen forbedret også hiPSC-ekspresjonen av SSEA-4 med 1,3 ganger. Differensiering av Matrix 2-AB-opprettholdt hiPSC førte til færre sfæroidutslipp i midt-/baktarmstadiet sammenlignet med de andre dyreavledede basalmembranene. Sammenlignet med andre fører den xenofrie organoidmatrisen (matrise 4-O3) til større og mer moden hIO, noe som tyder på at de fysiske egenskapene til xenofrie hydrogeler kan utnyttes for å optimalisere organoidgenerering. Til sammen tyder resultatene på at variasjoner i sammensetningen av forskjellige matriser påvirker stadier av IO-differensiering. Denne studien øker bevisstheten om forskjellene i kommersielt tilgjengelige matriser og gir en veiledning for matriseoptimalisering under iPSC- og IO-arbeid.

Introduction

Den ekstracellulære matrisen (ECM) er en dynamisk og multifunksjonell komponent i vev som spiller en sentral rolle i å regulere celleatferd og utvikling. Som et komplekst nettverk gir det strukturell støtte, cellelimligander¹ og lagring av vekstfaktorer og cytokiner som regulerer cellesignalering. For eksempel, under sårheling, fungerer ECM som et stillas for migrerende celler og som et reservoar av vekstfaktorer involvert i vevsreparasjon². På samme måte kan dysregulering i ECM føre til en økning i alvorlighetsgraden av ulike sykdommer som fibrose og kreft ^3,4. ....

Protocol

1. hiPSC-vedlikehold

FORSIKTIG: Alt arbeid utføres i et biosikkerhetsskap (BSC) etter standard aseptiske teknikker. Må følge OSHAs sikkerhetsstandarder for laboratorier, inkludert riktig bruk av personlig verneutstyr som laboratoriefrakker, hansker og vernebriller.

1. Fremstilling av matriser, alikvoter og cellekulturmedier
   1. For kommersielt tilgjengelige dyreavledede basalmembraner (BMs; Matrise 1-AB, Matrise 2-AB, Matrise 3-AB), forbered alikvoter av arbeidsvo.......

Discussion

Å velge det optimale mikromiljøet for stamcelle- og organoidarbeid er et sentralt tidlig skritt når du bruker disse plattformene til et bredt spekter av applikasjoner. Våre representative resultater viser at Matrix 4-XFO3, i kombinasjon med en høyere konsentrasjon av vekstfaktorer, fører til større organoider, noe som tyder på at de fysiske egenskapene til xenofrie hydrogeler kan utnyttes for å optimalisere organoidgenerering ved hjelp av disse systemene. Det er tidligere vist at de unike egenskapene til den eks.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K