Estudio comparativo de matrices de membrana basal para el mantenimiento de células madre humanas y la generación de organoides intestinales

Summary

Los organoides se han convertido en herramientas valiosas para el modelado de enfermedades. La matriz extracelular (ECM) guía el destino de las células durante la generación de organoides, y el uso de un sistema que se asemeje al tejido nativo puede mejorar la precisión del modelo. Este estudio compara la generación de organoides intestinales humanos derivados de células madre pluripotentes inducidas en ECM de origen animal e hidrogeles libres de xeno.

Abstract

La matriz extracelular (MEC) desempeña un papel fundamental en el comportamiento y el desarrollo celular. Los organoides generados a partir de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) están en el punto de mira de muchas áreas de investigación. Sin embargo, la falta de señales fisiológicas en los materiales de cultivo celular clásicos dificulta la diferenciación eficiente de iPSC. La incorporación de ECM disponible comercialmente en el cultivo de células madre proporciona señales físicas y químicas beneficiosas para el mantenimiento celular. Los productos de membrana basal de origen animal disponibles en el mercado están compuestos por proteínas ECM y factores de crecimiento que apoyan el mantenimiento celular. Dado que la MEC tiene propiedades específicas de los tejidos que pueden modular el destino de las células, se utilizan matrices libres de xeno para transmitir la traducción a los estudios clínicos. Si bien las matrices disponibles comercialmente se utilizan ampliamente en el trabajo de hiPSC y organoides, aún no se ha evaluado la equivalencia de estas matrices. En este trabajo se realizó un estudio comparativo del mantenimiento de hiPSC y la generación de organoides intestinales humanos (hIO) en cuatro matrices diferentes: Matrigel (Matriz 1-AB), Geltrex (Matriz 2-AB), Cultrex (Matriz 3-AB) y VitroGel (Matriz 4-XF). Aunque las colonias carecían de una forma perfectamente redonda, hubo una diferenciación espontánea mínima, con más del 85% de las células expresando el marcador de células madre SSEA-4. Matrix 4-XF condujo a la formación de grupos redondos en 3D. Además, el aumento de la concentración de suplementos y factores de crecimiento en los medios utilizados para fabricar la solución de hidrogel Matrix 4-XF mejoró la expresión de hiPSC de SSEA-4 en 1,3 veces. La diferenciación de la hiPSC mantenida por Matrix 2-AB condujo a menos liberaciones de esferoides durante la etapa del intestino medio/posterior en comparación con las otras membranas basales derivadas de animales. En comparación con otros, la matriz de organoides libres de xeno (Matriz 4-O3) conduce a hIO más grande y maduro, lo que sugiere que las propiedades físicas de los hidrogeles libres de xeno se pueden aprovechar para optimizar la generación de organoides. En conjunto, los resultados sugieren que las variaciones en la composición de diferentes matrices afectan a las etapas de diferenciación de la IO. Este estudio crea conciencia sobre las diferencias en las matrices disponibles comercialmente y proporciona una guía para la optimización de matrices durante el trabajo de iPSC e IO.

Introduction

La matriz extracelular (MEC) es un componente dinámico y multifuncional de los tejidos que desempeña un papel central en la regulación del comportamiento y el desarrollo celular. Como una red compleja, proporciona soporte estructural, ligandos adhesivos celulares¹ y almacenamiento de factores de crecimiento y citocinas que regulan la señalización celular. Por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, la MEC sirve como andamio para las células migratorias y como reservorio de factores de crecimiento implicados en^{la reparación de} los tejidos. Del mismo modo, la desregulación en la MEC puede conducir a un aumento de la ....

Protocol

1. Mantenimiento de hiPSC

PRECAUCIÓN: Todos los trabajos se realizan en una cabina de bioseguridad (BSC) siguiendo las técnicas asépticas estándar. Debe seguir las normas de seguridad de OSHA para laboratorios, incluido el uso adecuado de equipo de protección personal como batas de laboratorio, guantes y gafas.

1. Preparación de matrices, alícuotas y medios de cultivo celular
   1. En el caso de las membranas basales de origen animal disponibles en el mercado; M.......

Discussion

La selección del microentorno óptimo para el trabajo con células madre y organoides es un primer paso fundamental cuando se utilizan estas plataformas para una amplia gama de aplicaciones. Nuestros resultados representativos muestran que la matriz 4-XFO3, en combinación con una mayor concentración de factores de crecimiento, conduce a organoides más grandes, lo que sugiere que las propiedades físicas de los hidrogeles libres de xeno se pueden aprovechar para optimizar la generación de organoides utilizando estos .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K