Jämförande studie av basalmembranmatriser för underhåll av mänskliga stamceller och generering av tarmorganoider

Summary

Organoider har blivit värdefulla verktyg för sjukdomsmodellering. Den extracellulära matrisen (ECM) styr cellens öde under organoidgenerering, och genom att använda ett system som liknar den naturliga vävnaden kan modellens noggrannhet förbättras. I denna studie jämförs genereringen av inducerade pluripotenta stamcellshärledda humana tarmorganoider i ECM och xenofria hydrogeler från djur.

Abstract

Extracellulär matris (ECM) spelar en avgörande roll i cellens beteende och utveckling. Organoider som genereras från humant inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) står i rampljuset inom många forskningsområden. Bristen på fysiologiska signaler i klassiska cellodlingsmaterial hindrar dock effektiv iPSC-differentiering. Att införliva kommersiellt tillgänglig ECM i stamcellsodling ger fysiska och kemiska ledtrådar som är fördelaktiga för cellunderhåll. Animaliskt framställda kommersiellt tillgängliga basalmembranprodukter består av ECM-proteiner och tillväxtfaktorer som stöder cellunderhåll. Eftersom ECM har vävnadsspecifika egenskaper som kan modulera cellens öde, används xenofria matriser för att strömma upp översättningen till kliniska studier. Även om kommersiellt tillgängliga matriser används i stor utsträckning i hiPSC och organoidarbete, har ekvivalensen av dessa matriser ännu inte utvärderats. Här genomfördes en jämförande studie av hiPSC-underhåll och generering av humana tarmorganoider (hIO) i fyra olika matriser: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) och VitroGel (Matris 4-XF). Även om kolonierna saknade en perfekt rund form, fanns det minimal spontan differentiering, med över 85 % av cellerna som uttryckte stamcellsmarkören SSEA-4. Matris 4-XF ledde till bildandet av 3D runda klumpar. En ökning av koncentrationen av tillskotts- och tillväxtfaktorer i mediet som används för att tillverka Matrix 4-XF-hydrogellösningen förbättrade också hiPSC-uttrycket av SSEA-4 med 1,3 gånger. Differentiering av Matrix 2-AB-upprätthållen hiPSC ledde till färre sfäroidfrisättningar under mellan-/baktarmsstadiet jämfört med de andra animaliska basalmembranen. Jämfört med andra leder den xenofria organoidmatrisen (Matrix 4-O3) till större och mer mogen hIO, vilket tyder på att de fysikaliska egenskaperna hos xenofria hydrogeler kan utnyttjas för att optimera organoidgenereringen. Sammantaget tyder resultaten på att variationer i sammansättningen av olika matriser påverkar stadierna av IO-differentiering. Denna studie ökar medvetenheten om skillnaderna i kommersiellt tillgängliga matriser och ger en guide för matrisoptimering under iPSC- och IO-arbete.

Introduction

Den extracellulära matrisen (ECM) är en dynamisk och multifunktionell komponent i vävnader som spelar en central roll för att reglera cellbeteende och utveckling. Som ett komplext nätverk ger det strukturellt stöd, celladhesiva ligander¹ och lagring av tillväxtfaktorer och cytokiner som reglerar cellsignalering. Till exempel, under sårläkning, fungerar ECM som en ställning för migrerande celler och som en reservoar av tillväxtfaktorer som är involverade i vävnadsreparation². På samma sätt kan dysreglering i ECM leda till en ökning av svårighetsgraden av olika sjukdomar som fibros och cancer ^3....

Protocol

1. hiPSC-underhåll

VARNING: Allt arbete utförs i ett biosäkerhetsskåp (BSC) enligt standard aseptisk teknik. Måste följa OSHA:s säkerhetsstandarder för laboratorier, inklusive korrekt användning av personlig skyddsutrustning som labbrockar, handskar och skyddsglasögon.

1. Beredning av matriser, alikvoter och cellodlingssubstrat
   1. För kommersiellt tillgängliga animaliska basalmembran (BM; matris 1-AB, matris 2-AB, matris 3-AB), bereda delmängder av arbe.......

Discussion

Att välja den optimala mikromiljön för stamcells- och organoidarbete är ett avgörande tidigt steg när man använder dessa plattformar för ett brett spektrum av applikationer. Våra representativa resultat visar att Matrix 4-XFO3, i kombination med en högre koncentration av tillväxtfaktorer, leder till större organoider, vilket tyder på att de fysikaliska egenskaperna hos xenofria hydrogeler kan utnyttjas för att optimera organoidgenerering med hjälp av dessa system. Det har tidigare visats att de unika egens.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K