İnsan Kök Hücre Bakımı ve Bağırsak Organoid Üretimi için Bazal Membran Matrislerinin Karşılaştırmalı Çalışması

Summary

Organoidler, hastalık modellemesi için değerli araçlar haline geldi. Hücre dışı matris (ECM), organoid üretimi sırasında hücre kaderini yönlendirir ve doğal dokuya benzeyen bir sistem kullanmak model doğruluğunu artırabilir. Bu çalışma, hayvan kaynaklı ECM ve kseno içermeyen hidrojellerde indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilmiş insan bağırsak organoidlerinin üretimini karşılaştırmaktadır.

Abstract

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışı ve gelişiminde kritik bir rol oynar. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) üretilen organoidler birçok araştırma alanının ilgi odağındadır. Bununla birlikte, klasik hücre kültürü materyallerinde fizyolojik ipuçlarının olmaması, verimli iPSC farklılaşmasını engellemektedir. Ticari olarak temin edilebilen ECM'nin kök hücre kültürüne dahil edilmesi, hücre bakımı için faydalı fiziksel ve kimyasal ipuçları sağlar. Hayvansal kaynaklı ticari olarak temin edilebilen bazal membran ürünleri, hücre bakımını destekleyen ECM proteinleri ve büyüme faktörlerinden oluşur. ECM, hücre kaderini modüle edebilen dokuya özgü özelliklere sahip olduğundan, klinik çalışmalara translasyonu sağlamak için kseno içermeyen matrisler kullanılır. Ticari olarak temin edilebilen matrisler hiPSC ve organoid çalışmalarında yaygın olarak kullanılırken, bu matrislerin eşdeğerliği henüz değerlendirilmemiştir. Burada, dört farklı matriste hiPSC idame ve insan bağırsak organoidleri (hIO) oluşumunun karşılaştırmalı bir çalışması yapılmıştır: Matrigel (Matris 1-AB), Geltrex (Matris 2-AB), Cultrex (Matris 3-AB) ve VitroGel (Matris 4-XF). Koloniler mükemmel yuvarlak bir şekle sahip olmasalar da, hücrelerin %85'inden fazlasının kök hücre markörü SSEA-4'ü eksprese etmesiyle minimal spontan farklılaşma vardı. Matrix 4-XF, 3D yuvarlak kümelerin oluşumuna yol açtı. Ayrıca, Matrix 4-XF hidrojel çözeltisini yapmak için kullanılan ortamdaki takviye ve büyüme faktörlerinin konsantrasyonunun arttırılması, SSEA-4'ün hiPSC ekspresyonunu 1.3 kat iyileştirdi. Matris 2-AB ile korunan hiPSC'nin farklılaşması, diğer hayvan türevli bazal membranlara kıyasla orta/arka bağırsak aşamasında daha az sferoid salınımına yol açtı. Diğerleriyle karşılaştırıldığında, kseno içermeyen organoid matris (Matris 4-O3) daha büyük ve daha olgun hIO'ya yol açar, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin organoid oluşumunu optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürür. Toplamda, sonuçlar, farklı matrislerin bileşimindeki varyasyonların IO farklılaşmasının aşamalarını etkilediğini göstermektedir. Bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen matrislerdeki farklılıklar hakkında farkındalık yaratır ve iPSC ve IO çalışmaları sırasında matris optimizasyonu için bir kılavuz sağlar.

Introduction

Hücre dışı matriks (ECM), hücre davranışını ve gelişimini düzenlemede merkezi bir rol oynayan dokuların dinamik ve çok işlevli bir bileşenidir. Karmaşık bir ağ olarak, yapısal destek, hücre yapışkan ligandları¹ ve hücre sinyallemesini düzenleyen büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin depolanmasını sağlar. Örneğin, yara iyileşmesi sırasında, ECM, göç eden hücreler için bir iskele görevi görür ve doku onarımında yer alan büyüme faktörlerinin bir rezervuarı olarak işlev görür². Benzer şekilde, ECM'deki düzensizlik, fibroz ve kanser gibi çeşitli hastalıkların şiddetinde bir artışa yol açabilir ^3,4<....

Protocol

1. hiPSC bakımı

DİKKAT: Tüm çalışmalar, standart aseptik teknikler izlenerek bir Biyogüvenlik Kabininde (BSC) yapılır. Laboratuvar önlükleri, eldivenler ve gözlükler gibi kişisel koruyucu ekipmanların uygun kullanımı da dahil olmak üzere laboratuvarlar için OSHA güvenlik standartlarına uymalıdır.

1. Matrislerin, alikotların ve hücre kültürü ortamlarının hazırlanması
   1. Ticari olarak temin edilebilen hayvan kaynaklı bazal membranlar .......

Discussion

Kök hücre ve organoid çalışmaları için en uygun mikro ortamın seçilmesi, bu platformları çok çeşitli uygulamalar için kullanırken çok önemli bir erken adımdır. Temsili sonuçlarımız, Matrix 4-XFO3'ün daha yüksek konsantrasyonda büyüme faktörleri ile kombinasyon halinde daha büyük organoidlere yol açtığını göstermektedir, bu da kseno içermeyen hidrojellerin fiziksel özelliklerinin bu sistemler kullanılarak organoid üretimini optimize etmek için kullanılabileceğini düşündürmekte.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Plate (Culture treated, sterile)	Falcon	353504
37 °C water bath	VWR
96-well plate	Fisher Scientific	FB012931
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634
Anti-adherence Rinsing Solutio	STEMCELL Technologies	7010
Biological safety cabinet (BSC)	Labconco	Logic
Brightfield Microscope	Echo Rebel	REB-01-E2
BXS0116	ATCC	ACS-1030
Centrifuge with temperature control (4 °C capabilities)	ThermoScientific	75002441
Conical tubes, 15 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339650
Conical tubes, 50 mL, sterile	Thermo Fisher Scientific	339652
Cultrex RGF BME, Type 2	Bio-techne	3533-005-02
Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME	Bio-techne	3434-010-02
D-PBS (Without Ca++ and Mg++)	Thermo Fisher Scientific	14190144
GeltrexLDEV-Free, hESC-Qualified Reduce Growth Factor	Gibco	A14133-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Guava Muse Cell Analyzer or another flow cytometry equipment (optional)	Luminex	0500-3115
HEPES buffer solution	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Heralcell Vios Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2)	Thermo Scientific	51033775
JMP Software	SAS Institute	JMP 16
MATLAB	MathWorks, Inc	R2022b
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix LDEV free	Corning	356231
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Growth Factor Reduced (GFR) LDEV-free	Corning	354263
mTeSR Plus Medium	STEMCELL Technologies	100-0276
Nunclon Delta surface treated 24-well plate	Thermo Scientific	144530
PE Mouse Anti-human CD326 (EpCAM)	BD Pharmingen	566841
PE Mouse Anti-human CDX2	BD Pharmingen	563428
PE Mouse Anti-human FOXA2	BD Pharmingen	561589
PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-human SSEA4	BD Pharmingen	561565
ReLeSR	STEMCELL	5872
SCTi003-A	STEMCELL Technologies	200-0510
Serological pipettes (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Serological pipettes (5 mL)	Fisher Scientific	13-678-11D
STEMdiff Intestinal Organoid Growth Medium	STEMCELL Technologies	5145
STEMdiff Intestinal Organoid Kit	STEMCELL Technologies	5140
Vitrogel Hydrogel Matrix	TheWell Bioscience	VHM01
VitroGel ORGANOID Discovery Kit	TheWell Bioscience	VHM04-K