Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Описан метод изучения того, как рН реагирует на сигналы окружающей среды в гликосомах кровавой формы африканских трипаносом. Этот подход включает в себя чувствительный к рН наследственный белковый сенсор в сочетании с проточной цитометрией для измерения динамики рН, как в виде анализа по времени, так и в формате высокопроизводительного скрининга.

Abstract

Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для африканской трипаносомы, Trypanosoma brucei, как важнейший метаболический процесс и регулятор развития паразитов. Мало что известно о клеточных реакциях, возникающих при изменении уровня глюкозы в окружающей среде. Как у кровотоковых, так и у проциклических (стадия насекомого) паразитов гликосома содержит большую часть гликолиза. Эти органеллы быстро подкисляются в ответ на недостаток глюкозы, что, вероятно, приводит к аллостерической регуляции гликолитических ферментов, таких как гексокиназа. В предыдущей работе локализация химического зонда, используемого для измерения pH, была сложной задачей, что ограничивало его полезность в других приложениях.

В данной работе описывается разработка и использование паразитов, экспрессирующих гликозомно локализованный pHluorin2, наследуемый белковый биосенсор рН. pHluorin2 представляет собой ратиометрический вариант pHluorin, который демонстрирует pH-зависимое (кислотно-зависимое) снижение возбуждения на длине волны 395 нм с одновременным увеличением возбуждения на длине волны 475 нм. Трансгенные паразиты были получены путем клонирования открытой рамки считывания pHluorin2 в вектор экспрессии трипаносом pLEW100v5, что позволило индуцировать экспрессию белка на любой стадии жизненного цикла. Иммунофлуоресценцию использовали для подтверждения гликосомной локализации биосенсора pHluorin2, сравнивая локализацию биосенсора с гликосомным резидентным белком альдолазой. Чувствительность датчика была откалибрована при различных уровнях pH путем инкубации клеток в серии буферов с диапазоном pH от 4 до 8, подход, который мы ранее использовали для калибровки датчика pH на основе флуоресцеина. Затем мы измерили флуоресценцию pHluorin2 на длинах волны 405 нм и 488 нм с помощью проточной цитометрии для определения гликосомального рН. Мы валидировали эффективность живых трансгенных паразитов, экспрессирующих pHluorin2, отслеживая рН с течением времени в ответ на депривацию глюкозы, известный триггер гликозомального закисления у паразитов ЛП. Этот инструмент имеет ряд потенциальных применений, в том числе потенциально может быть использован для высокопроизводительного скрининга наркотиков. Помимо гликозомального рН, сенсор может быть адаптирован к другим органеллам или использован в других трипаносоматидах для понимания динамики рН в условиях живой клетки.

Introduction

Паразитические кинетопластиды, как и большинство живых организмов, полагаются на глюкозу как на фундаментальный компонент центрального метаболизма углерода. В эту группу входят важные с медицинской точки зрения организмы, такие как африканская трипаносома, Trypanosoma brucei; американская трипаносома T. cruzi; и паразиты рода Leishmania. Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для роста паразитов на стадиях патогенного жизненного цикла. Например, при лишении глюкозы форма кровотока (BSF) африканской трипаносомы быстро погибает. Примечательно, что гликолиз служит единственным источником АТФ на этой стадии инфекции1.....

Protocol

Использование трипаносом T. brucei brucei 90-13 BSF, мономорфной линии паразитов, требует рассмотрения вопросов безопасности, поскольку они считаются организмами 2-й группы риска, с которыми следует обращаться на объектах 2-го уровня биобезопасности.

1. Культивирование и тр?.......

Representative Results

Локализация pHLuorin2-PTS1 в гликосомах у BSF T. brucei
Для оценки субклеточной локализации pHluorin2-PTS1 паразитов подвергали иммунофлюоресцентным анализам. Сигнал от трансгена, локализованного с антисыворотками, повышенными против гликозомно-резидентного белка альдолазы (TbAldolase) (

Discussion

Восприятие окружающей среды и механизмы реагирования африканской трипаносомы плохо изучены. Известно, что изменения в доступности питательных веществ вызывают различные реакции у паразита, включая закисление гликосом. В данной работе мы описали метод изучения реакции гликосомного р.......

Acknowledgements

pHluorin2-PTS1 был клонирован в pLEW100v5 компанией Twist Bioscience, которая предоставила конструкцию в векторе клонирования с высокой степенью копии; pLEW100v5 был подарком от доктора Джорджа Кросса. Антисыворотка, выращенная против T. brucei aldolase, можно получить у доктора Мередит Т. Моррис из Университета Клемсона по запросу. Работа лабораторий JCM и KAC была частично поддержана премией Национальных институтов здравоохранения (R01AI156382). SSP был поддержан NIH 3R01AI156382.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)VWR10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)Corning431464U
80 µL flat-bottom 384-well plateBrandTech 781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  KitLonzaVPA-1002
Attune NxT Flow Cytometerinvitrogen by Thermo Fisher ScientificA24858FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plateMillipore SigmaBR781662
Coloc 2 plugin of ImageJhttps://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Samplerinvitrogen by Thermo Fisher ScientificA42973
CytoFLEX Flow CytometerBeckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL AmpouleFisher Scientific50-980-487
GraphPad Prismstatistical software
Nigericin (sodium salt)Cayman Chemical11437
Nucleofector 2bLonzaDiscontinued Product
OP2 Liquid HandleropentronsOP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2OSigma Life ScienceCAS:25988-63-0Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)biotium#40087We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycinCayman Chemical10009152Pipetting robot for HTS assay
      For pH calibration
      For pH calibration

References

  1. Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development. Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).
  2. Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J.

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved