Измерение динамических изменений рН гликосом у живой Trypanosoma brucei

Summary

Описан метод изучения того, как рН реагирует на сигналы окружающей среды в гликосомах кровавой формы африканских трипаносом. Этот подход включает в себя чувствительный к рН наследственный белковый сенсор в сочетании с проточной цитометрией для измерения динамики рН, как в виде анализа по времени, так и в формате высокопроизводительного скрининга.

Abstract

Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для африканской трипаносомы, Trypanosoma brucei, как важнейший метаболический процесс и регулятор развития паразитов. Мало что известно о клеточных реакциях, возникающих при изменении уровня глюкозы в окружающей среде. Как у кровотоковых, так и у проциклических (стадия насекомого) паразитов гликосома содержит большую часть гликолиза. Эти органеллы быстро подкисляются в ответ на недостаток глюкозы, что, вероятно, приводит к аллостерической регуляции гликолитических ферментов, таких как гексокиназа. В предыдущей работе локализация химического зонда, используемого для измерения pH, была сложной задачей, что ограничивало его полезность в других приложениях.

В данной работе описывается разработка и использование паразитов, экспрессирующих гликозомно локализованный pHluorin2, наследуемый белковый биосенсор рН. pHluorin2 представляет собой ратиометрический вариант pHluorin, который демонстрирует pH-зависимое (кислотно-зависимое) снижение возбуждения на длине волны 395 нм с одновременным увеличением возбуждения на длине волны 475 нм. Трансгенные паразиты были получены путем клонирования открытой рамки считывания pHluorin2 в вектор экспрессии трипаносом pLEW100v5, что позволило индуцировать экспрессию белка на любой стадии жизненного цикла. Иммунофлуоресценцию использовали для подтверждения гликосомной локализации биосенсора pHluorin2, сравнивая локализацию биосенсора с гликосомным резидентным белком альдолазой. Чувствительность датчика была откалибрована при различных уровнях pH путем инкубации клеток в серии буферов с диапазоном pH от 4 до 8, подход, который мы ранее использовали для калибровки датчика pH на основе флуоресцеина. Затем мы измерили флуоресценцию pHluorin2 на длинах волны 405 нм и 488 нм с помощью проточной цитометрии для определения гликосомального рН. Мы валидировали эффективность живых трансгенных паразитов, экспрессирующих pHluorin2, отслеживая рН с течением времени в ответ на депривацию глюкозы, известный триггер гликозомального закисления у паразитов ЛП. Этот инструмент имеет ряд потенциальных применений, в том числе потенциально может быть использован для высокопроизводительного скрининга наркотиков. Помимо гликозомального рН, сенсор может быть адаптирован к другим органеллам или использован в других трипаносоматидах для понимания динамики рН в условиях живой клетки.

Introduction

Паразитические кинетопластиды, как и большинство живых организмов, полагаются на глюкозу как на фундаментальный компонент центрального метаболизма углерода. В эту группу входят важные с медицинской точки зрения организмы, такие как африканская трипаносома, Trypanosoma brucei; американская трипаносома T. cruzi; и паразиты рода Leishmania. Метаболизм глюкозы имеет решающее значение для роста паразитов на стадиях патогенного жизненного цикла. Например, при лишении глюкозы форма кровотока (BSF) африканской трипаносомы быстро погибает. Примечательно, что гликолиз служит единственным источником АТФ на этой стадии инфекции¹.....

Protocol

Использование трипаносом T. brucei brucei 90-13 BSF, мономорфной линии паразитов, требует рассмотрения вопросов безопасности, поскольку они считаются организмами 2-й группы риска, с которыми следует обращаться на объектах 2-го уровня биобезопасности.

1. Культивирование и тр?.......

Discussion

Восприятие окружающей среды и механизмы реагирования африканской трипаносомы плохо изучены. Известно, что изменения в доступности питательных веществ вызывают различные реакции у паразита, включая закисление гликосом. В данной работе мы описали метод изучения реакции гликосомного р.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)	VWR	10861-572
75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)	Corning	431464U
80 µL flat-bottom 384-well plate	BrandTech	781620
Amaxa Human T Cell Nucleofector  Kit	Lonza	VPA-1002
Attune NxT Flow Cytometer	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A24858	FlowJo software
BRANDplates 96-Well, flat bottom plate	Millipore Sigma	BR781662
Coloc 2 plugin of ImageJ			https://imagej.net/plugins/coloc-2
CytKick Max Auto Sampler	invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A42973
CytoFLEX Flow Cytometer	Beckman-Coulter
Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule	Fisher Scientific	50-980-487
GraphPad Prism			statistical software
Nigericin (sodium salt)	Cayman Chemical	11437
Nucleofector 2b	Lonza	Discontinued Product
OP2 Liquid Handler	opentrons	OP2
poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O	Sigma Life Science	CAS:25988-63-0	Pipetting robot for HTS assay
Thiazole Red (TO-PRO-3)	biotium	#40087	We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler
valinomycin	Cayman Chemical	10009152	Pipetting robot for HTS assay
			For pH calibration
			For pH calibration