A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.
בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.
כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.
אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.
כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים1. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה 2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR 4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שי....
1. הכנת תבנית הגן PRRSV
במאמר זה אנו מציגים מערכת רקומבינציה במבחנה להרכבה ותיקון של מולקולות דנ"א חופפות באמצעות פריימר הפוך באמצעות אתרי הגבלה שמוצגים ללא הרף (איור 1B). מערכת זו היא הליך פשוט ויעיל הכולל את הכנת הווקטור הליניארי ואת קטעי ההוספה המכילים שלוחות שהוכנסו על ידי PCR עם פריימרים ב.......
טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA8. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים .......
עבודה זו נתמכה על ידי התמיכה הכספית של קרנות ייזום מחקר דוקטורט שסופקו על ידי אוניברסיטת סין מערב נורמלי (מס '20E059).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved