גישת שיבוט חלקה לבנייה וקטורית של ביטוי וירוסים ברבייה חזירית ובתסמונת הנשימה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

Abstract

בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.

כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.

אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.

Introduction

כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים¹. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה ^2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR ^4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שי....

Protocol

1. הכנת תבנית הגן PRRSV

1. הפשיר את מלאי הנגיף ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).
2. מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. דוגרים במשך 3 דקות.
3. צנטריפוגה את התערובת במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 ° C.
   הערה: התערובת מחולקת לשלושה שלבים, כלומר, שלב מימי חסר צבע, של.......

Discussion

טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA⁸. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent