Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקבלת וקטור הביטוי pVAX1-PRRSV על ידי הצגת אתרי הגבלה מתאימים בקצה 3' של התוספות. אנו יכולים להפוך את הווקטור לליניארי ולחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה באמצעות טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית.

Abstract

בניית וקטורים של ביטוי גנים היא מרכיב חשוב בעבודת מעבדה בביולוגיה ניסויית. עם פיתוחים טכניים כמו Gibson Assembly, הבנייה הווקטורית הופכת לפשוטה ויעילה יחסית. עם זאת, כאשר הגנום באורך מלא של וירוס הרבייה והנשימה החזירי (PRRSV) אינו יכול להיות מוגבר בקלות על ידי תגובת שרשרת פולימראז יחידה (PCR) מ- cDNA, או שקשה לרכוש וקטור ביטוי גנים באורך מלא על ידי רקומבינציה הומולוגית של תוספות מרובות במבחנה, טכניקת הרכבת גיבסון הנוכחית אינה מצליחה להשיג מטרה זו.

כתוצאה מכך, מטרתנו הייתה לחלק את גנום PRRSV למספר מקטעים ולהכניס אתרי הגבלה מתאימים לתוך הפריימר ההפוך לקבלת מקטעים מוגברים PCR. לאחר חיבור מקטע הדנ"א הקודם לווקטור על ידי טכנולוגיית רקומבינציה הומולוגית, הווקטור החדש רכש את אתר המחשוף של אנזים ההגבלה. לפיכך, אנו יכולים ליצור ליניאריזציה של הווקטור באמצעות אתר מחשוף האנזים החדש שנוסף ולהציג את מקטע הדנ"א הבא במורד הזרם של מקטע הדנ"א במעלה הזרם.

אתר המחשוף של אנזים ההגבלה שהוכנס בקצה 3' של מקטע הדנ"א במעלה הזרם יבוטל, ואתר מחשוף חדש יוכנס לקצה 3' של מקטע הדנ"א במורד הזרם. בדרך זו אנו יכולים לחבר מקטעי דנ"א לווקטור בזה אחר זה. שיטה זו ישימה לבנייה מוצלחת של וקטור ביטוי PRRSV והיא שיטה יעילה להרכבת מספר רב של שברים לווקטור הביטוי.

Introduction

כטכניקה חיונית לבניית כלים ניסיוניים מבוססי דנ"א לביטוי בתאים פרוקריוטים ואיקריוטים, שיבוט מולקולרי הוא מרכיב חשוב מאוד בביולוגיה הניסויית. שיבוט מולקולרי כרוך בארבעה תהליכים: רכישת DNA מוחדר, קשירת האינסרט לווקטור המתאים, טרנספורמציה של הווקטור הרקומביננטי ל- Escherichia coli (E. coli), וזיהוי השיבוטים החיוביים1. עד כה אומצו שיטות רבות לצירוף מולקולות DNA באמצעות אנזימי הגבלה 2,3 ורקומבינציה בתיווך PCR 4,5,6. רקומבינציה הומולוגית, הידועה בשם טכנולוגיית שיבוט חלק, היא קבוצת שי....

Protocol

1. הכנת תבנית הגן PRRSV

  1. הפשיר את מלאי הנגיף ב 1 מ"ל של מגיב מיצוי RNA (ראה טבלת חומרים).
  2. מוסיפים 0.2 מ"ל כלורופורם ומערבבים היטב. דוגרים במשך 3 דקות.
  3. צנטריפוגה את התערובת במשך 15 דקות ב 12,000 × גרם ב 4 ° C.
    הערה: התערובת מחולקת לשלושה שלבים, כלומר, שלב מימי חסר צבע, של.......

Representative Results

במאמר זה אנו מציגים מערכת רקומבינציה במבחנה להרכבה ותיקון של מולקולות דנ"א חופפות באמצעות פריימר הפוך באמצעות אתרי הגבלה שמוצגים ללא הרף (איור 1B). מערכת זו היא הליך פשוט ויעיל הכולל את הכנת הווקטור הליניארי ואת קטעי ההוספה המכילים שלוחות שהוכנסו על ידי PCR עם פריימרים ב.......

Discussion

טכניקת ההרכבה של גיבסון (באנגלית: Gibson assembly technique) היא שיטת שיבוט מולקולרי מבוססת רקומבינציה חוץ גופית להרכבת מקטעי DNA8. שיטה זו מאפשרת הרכבה של מקטעי דנ"א מרובים לפלסמיד מעגלי בתגובה איזותרמית של צינור יחיד. עם זאת, אחד המכשולים לטכניקת הרכבת גיבסון הוא רכישת מקטעים ארוכים .......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי התמיכה הכספית של קרנות ייזום מחקר דוקטורט שסופקו על ידי אוניברסיטת סין מערב נורמלי (מס '20E059).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, ....

Explore More Articles

PRRSVPCRDNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved