Un approccio di clonazione senza soluzione di continuità per la costruzione di vettori di espressione del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria dei suini

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere il vettore di espressione di pVAX1-PRRSV introducendo opportuni siti di restrizione all'estremità 3' degli inserti. Possiamo linearizzare il vettore e unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno attraverso la tecnologia di ricombinazione omologa.

Abstract

La costruzione di vettori di espressione genica è una componente importante del lavoro di laboratorio in biologia sperimentale. Con i progressi tecnici come Gibson Assembly, la costruzione vettoriale diventa relativamente semplice ed efficiente. Tuttavia, quando il genoma completo del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV) non può essere facilmente amplificato da una singola reazione a catena della polimerasi (PCR) dal cDNA, o è difficile acquisire un vettore di espressione genica a lunghezza intera mediante ricombinazione omologa di più inserti in vitro, l'attuale tecnica di assemblaggio di Gibson non riesce a raggiungere questo obiettivo.

Di conseguenza, abbiamo mirato a dividere il genoma del PRRSV in diversi frammenti e a introdurre siti di restrizione appropriati nel primer inverso per ottenere frammenti amplificati con PCR. Dopo aver unito il precedente frammento di DNA nel vettore mediante la tecnologia di ricombinazione omologa, il nuovo vettore ha acquisito il sito di scissione dell'enzima di restrizione. Pertanto, possiamo linearizzare il vettore utilizzando il sito di scissione enzimatica appena aggiunto e introdurre il successivo frammento di DNA a valle del frammento di DNA a monte.

Il sito di scissione dell'enzima di restrizione introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a monte sarà eliminato e un nuovo sito di scissione sarà introdotto all'estremità 3' del frammento di DNA a valle. In questo modo, possiamo unire i frammenti di DNA al vettore uno per uno. Questo metodo è applicabile per costruire con successo il vettore di espressione PRRSV ed è un metodo efficace per assemblare un gran numero di frammenti nel vettore di espressione.

Introduction

Come tecnica essenziale per costruire strumenti sperimentali basati sul DNA per l'espressione in cellule procariotiche ed eucariotiche, il clonaggio molecolare è una componente molto importante della biologia sperimentale. Il clonaggio molecolare prevede quattro processi: l'acquisizione del DNA dell'inserto, la legatura dell'inserto nel vettore appropriato, la trasformazione del vettore ricombinante in Escherichia coli (E. coli) e l'identificazione dei cloni positivi¹. Finora, sono stati adottati diversi metodi per unire le molecole di DNA utilizzando gli enzimi di restrizione ^2,3

Protocol

1. Preparazione del modello del gene PRRSV

1. Scongelare lo stock virale in 1 mL di reagente per l'estrazione dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali).
2. Aggiungere 0,2 mL di cloroformio e mescolare accuratamente. Incubare per 3 min.
3. Centrifugare la miscela per 15 minuti a 12.000 × g a 4 °C.
   NOTA: La miscela è divisa in tre fasi, vale a dire una fase acquosa incolore, un'interfase e una fase fenolo-cloroformio rosso.
4. Pipett la fase acqu.......

Discussion

La tecnica di assemblaggio di Gibson è un metodo di clonaggio molecolare basato sulla ricombinazione in vitro per l'assemblaggio di frammenti di DNA⁸. Questo metodo consente l'assemblaggio di più frammenti di DNA in un plasmide circolare in una reazione isotermica a provetta singola. Tuttavia, uno degli ostacoli alla tecnica di assemblaggio di Gibson è l'acquisizione di lunghi frammenti dal cDNA. I frammenti lunghi sono difficili da amplificare con precisione per molte ragioni. Ad esem.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent