ブタ繁殖呼吸器症候群ウイルス発現ベクター構築のためのシームレスクローニングアプローチ

遺伝子発現ベクターの構築は、実験生物学における実験室研究の重要な要素です。Gibson Assemblyのような技術の進歩により、ベクトル構築は比較的簡単で効率的になります。しかし、ブタ生殖呼吸器症候群ウイルス(PRRSV)の完全長ゲノムがcDNAからの単一ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって容易に増幅できない場合、または複数のインサートを in vitroで相同組換えして完全長遺伝子発現ベクターを取得することが困難な場合、現在のギブソンアセンブリ技術ではこの目標を達成することができません。

そこで、PRRSVゲノムをいくつかのフラグメントに分割し、リバースプライマーに適切な制限部位を導入してPCR増幅フラグメントを得ることを目指しました。相同組換え技術により、以前のDNA断片をベクターに結合した後、新しいベクターは制限酵素切断部位を獲得した。このように、新たに追加された酵素切断部位を用いてベクターを直鎖化し、上流のDNA断片の下流に次のDNA断片を導入することができます。

上流のDNA断片の3'末端に導入された制限酵素切断部位は排除され、新しい切断部位が下流DNA断片の3'末端に導入されます。このようにして、DNA断片を1つずつベクターに結合することができます。この方法は、PRRSV発現ベクトルをうまく構築するために適用可能であり、多数のフラグメントを発現ベクトルに組み立てるのに有効な方法です。