En sømløs kloningstilnærming for svinereproduktivt og respiratorisk syndrom virusekspresjonsvektorkonstruksjon

Konstruksjonen av genekspresjonsvektorer er en viktig komponent i laboratoriearbeid i eksperimentell biologi. Med tekniske fremskritt som Gibson Assembly blir vektorkonstruksjon relativt enkel og effektiv. Men når genomet i full lengde til Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) ikke lett kan amplifiseres av en enkelt polymerasekjedereaksjon (PCR) fra cDNA, eller det er vanskelig å skaffe seg en genekspresjonsvektor i full lengde ved homolog rekombinasjon av flere innsatser in vitro, klarer ikke den nåværende Gibson Assembly-teknikken å oppnå dette målet.

Følgelig hadde vi som mål å dele PRRSV-genomet i flere fragmenter og introdusere passende restriksjonssteder i den omvendte primeren for å oppnå PCR-amplifiserte fragmenter. Etter å ha sammenføyd det forrige DNA-fragmentet inn i vektoren ved hjelp av homolog rekombinasjonsteknologi, fikk den nye vektoren restriksjonsenzymets spaltningssted. Dermed kan vi linearisere vektoren ved å bruke det nylig tilsatte enzymspaltningsstedet og introdusere det neste DNA-fragmentet nedstrøms for oppstrøms DNA-fragmentet.

Det introduserte restriksjonsenzymspaltningsstedet i 3'-enden av oppstrøms DNA-fragmentet vil bli eliminert, og et nytt spaltningssted vil bli introdusert i 3'-enden av nedstrøms DNA-fragmentet. På denne måten kan vi koble DNA-fragmenter til vektoren en etter en. Denne metoden er anvendelig for å lykkes med å konstruere PRRSV-ekspresjonsvektoren og er en effektiv metode for å sette sammen et stort antall fragmenter i ekspresjonsvektoren.