Uma abordagem de clonagem perfeita para a construção do vetor de expressão do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.

Abstract

A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.

Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.

O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.

Introduction

Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos¹. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição ^2,3 e recombinação mediada p....

Protocol

1. Preparação do molde do gene PRRSV

1. Descongele o estoque de vírus em 1 mL de reagente de extração de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio e misture bem. Incubar por 3 min.
3. Centrifugue a mistura durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
   NOTA: A mistura é dividida em três fases, a saber, uma fase aquosa incolor, uma interfase e uma fase vermelha de fenol-clorofórmio.
4. Pipetar a fase aquosa incolor e tr.......

Discussion

A técnica de montagem de Gibson é um método de clonagem molecular baseado em recombinação in vitro para a montagem de fragmentos de DNA⁸. Este método permite a montagem de vários fragmentos de DNA em um plasmídeo circular em uma reação isotérmica de tubo único. No entanto, um dos obstáculos para a técnica de Montagem de Gibson é a aquisição de longos fragmentos do cDNA. Os fragmentos longos são difíceis de amplificar com precisão por vários motivos. Por exemplo, os pr.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent