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Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.
A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.
Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.
O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.
Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos1. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição 2,3 e recombinação mediada p....
1. Preparação do molde do gene PRRSV
Neste artigo, apresentamos um sistema de recombinação in vitro para montar e reparar moléculas de DNA sobrepostas usando o primer reverso por meio de locais de restrição continuamente introduzidos (Figura 1B). Este sistema é um procedimento simples e eficiente que compreende a preparação do vetor linear e dos fragmentos de inserção contendo saliências introduzidas por PCR com primers com sequências de extensão 5' e locais de restrição apropriados; uma reacção isoté.......
A técnica de montagem de Gibson é um método de clonagem molecular baseado em recombinação in vitro para a montagem de fragmentos de DNA8. Este método permite a montagem de vários fragmentos de DNA em um plasmídeo circular em uma reação isotérmica de tubo único. No entanto, um dos obstáculos para a técnica de Montagem de Gibson é a aquisição de longos fragmentos do cDNA. Os fragmentos longos são difíceis de amplificar com precisão por vários motivos. Por exemplo, os pr.......
Este trabalho foi apoiado pelo apoio financeiro dos fundos de iniciação à pesquisa de doutorado fornecidos pela China West Normal University (nº 20E059).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb plus DNA Ladder | Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd | MD113-02 | |
2x Universal Green PCR Master Mix | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A303-1 | |
Agarose | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | 9012-36-6 | |
Benchtop Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FRESCO17 | |
Clean Bench | Sujing Antai Air Technology Co., Ltd | VD-650-U | |
DNA Electrophoresis Equipment | Cleaver Scientific Co., Ltd | 170905117 | |
DNA Loading Buffer (6x) | Biosharp Biotechnology Co., Ltd | BL532A | |
E. Z. N. A. Gel Extraction kit | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D2500-01 | |
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I | Omega Bio-Tek Co., Ltd | D6943-01 | |
Electro-heating Standing-temperature Cultivator | Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd | DHP-9082 | |
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A101-02 | |
ExonScript RT SuperMix with dsDNase | Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd | A502-1 | |
FastDigest Eco321 (EcoRV) | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0303 | |
FastDigest HindIII | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0504 | |
FastDigest NheI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0974 | |
FastDigest NotI | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | FD0596 | |
Gel Doc XR | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | 721BR07925 | |
Goldview Nucleic Acid Gel Stain | Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd | YB10201ES03 | |
Ice Maker Machine | Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd | FMB100 | |
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 12361010 | |
LB Agar Plate (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B530113-0010 | |
LB sterile liquid medium (Kanamycin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B540113-0001 | |
Micropipettors | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | — | |
Microwave Oven | Panasonic Electric (China) Co., Ltd | NN-GM333W | |
Orbital Shakers | Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd | ZHWY-2102C | |
PRRSV virus | Sichuan Agricultural University | — | |
SnapGene | GSL Biotech, LLC | v5.1 | To design primers |
T100 PCR Gradient Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories Co., Ltd | T100 Thermal Cycler | |
TAE buffer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | B040123-0010 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific Co., Ltd | 15596026 | RNA extraction reagent |
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