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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para obter o vetor de expressão pVAX1-PRRSV introduzindo locais de restrição adequados na extremidade 3' das inserções. Podemos linearizar o vetor e unir fragmentos de DNA ao vetor um por um por meio da tecnologia de recombinação homóloga.

Abstract

A construção de vetores de expressão gênica é um componente importante do trabalho de laboratório em biologia experimental. Com avanços técnicos como o Gibson Assembly, a construção vetorial torna-se relativamente simples e eficiente. No entanto, quando o genoma completo do Vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Suína (PRRSV) não pode ser facilmente amplificado por uma única reação em cadeia da polimerase (PCR) do cDNA, ou é difícil adquirir um vetor de expressão gênica de comprimento total por recombinação homóloga de múltiplas inserções in vitro, a atual técnica de montagem de Gibson não consegue atingir esse objetivo.

Consequentemente, nosso objetivo foi dividir o genoma do PRRSV em vários fragmentos e introduzir locais de restrição apropriados no primer reverso para a obtenção de fragmentos amplificados por PCR. Depois de unir o fragmento de DNA anterior ao vetor por tecnologia de recombinação homóloga, o novo vetor adquiriu o local de clivagem da enzima de restrição. Assim, podemos linearizar o vetor usando o local de clivagem enzimática recém-adicionado e introduzir o próximo fragmento de DNA a jusante do fragmento de DNA a montante.

O local de clivagem da enzima de restrição introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a montante será eliminado e um novo local de clivagem será introduzido na extremidade 3' do fragmento de DNA a jusante. Desta forma, podemos unir fragmentos de DNA ao vetor um por um. Este método é aplicável para construir com sucesso o vetor de expressão PRRSV e é um método eficaz para montar um grande número de fragmentos no vetor de expressão.

Introduction

Como uma técnica essencial para construir ferramentas experimentais baseadas em DNA para expressão em células procarióticas e eucarióticas, a clonagem molecular é um componente muito importante da biologia experimental. A clonagem molecular envolve quatro processos: a aquisição do DNA da inserção, a ligação da inserção no vetor apropriado, a transformação do vetor recombinante em Escherichia coli (E. coli) e a identificação dos clones positivos1. Até agora, vários métodos foram adotados para unir moléculas de DNA usando enzimas de restrição 2,3 e recombinação mediada p....

Protocol

1. Preparação do molde do gene PRRSV

  1. Descongele o estoque de vírus em 1 mL de reagente de extração de RNA (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Adicione 0,2 mL de clorofórmio e misture bem. Incubar por 3 min.
  3. Centrifugue a mistura durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: A mistura é dividida em três fases, a saber, uma fase aquosa incolor, uma interfase e uma fase vermelha de fenol-clorofórmio.
  4. Pipetar a fase aquosa incolor e tr.......

Representative Results

Neste artigo, apresentamos um sistema de recombinação in vitro para montar e reparar moléculas de DNA sobrepostas usando o primer reverso por meio de locais de restrição continuamente introduzidos (Figura 1B). Este sistema é um procedimento simples e eficiente que compreende a preparação do vetor linear e dos fragmentos de inserção contendo saliências introduzidas por PCR com primers com sequências de extensão 5' e locais de restrição apropriados; uma reacção isoté.......

Discussion

A técnica de montagem de Gibson é um método de clonagem molecular baseado em recombinação in vitro para a montagem de fragmentos de DNA8. Este método permite a montagem de vários fragmentos de DNA em um plasmídeo circular em uma reação isotérmica de tubo único. No entanto, um dos obstáculos para a técnica de Montagem de Gibson é a aquisição de longos fragmentos do cDNA. Os fragmentos longos são difíceis de amplificar com precisão por vários motivos. Por exemplo, os pr.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo apoio financeiro dos fundos de iniciação à pesquisa de doutorado fornecidos pela China West Normal University (nº 20E059).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

References

  1. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  2. Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J. Biol. Eng. 2, 5 (2008).
  3. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, ....

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Palavras chave ClonagemPRRSVVetor de Express oMontagem de GibsonPCRS tios de Restri oRecombina o Hom logaMontagem de Fragmentos de DNA

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