En sömlös kloningsmetod för Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

Konstruktionen av genuttrycksvektorer är en viktig komponent i laboratoriearbete inom experimentell biologi. Med tekniska framsteg som Gibson Assembly blir vektorkonstruktion relativt enkel och effektiv. Men när hela genomet av Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) inte lätt kan amplifieras genom en enda polymeraskedjereaktion (PCR) från cDNA, eller det är svårt att förvärva en fullängds genuttrycksvektor genom homolog rekombination av flera insatser in vitro, misslyckas den nuvarande Gibson Assembly-tekniken med att uppnå detta mål.

Följaktligen strävade vi efter att dela upp PRRSV-genomet i flera fragment och införa lämpliga restriktionsställen i den omvända primern för att erhålla PCR-amplifierade fragment. Efter att ha förenat det tidigare DNA-fragmentet med vektorn genom homolog rekombinationsteknik, förvärvade den nya vektorn klyvningsstället för restriktionsenzymet. Således kan vi linjärisera vektorn genom att använda det nyligen tillagda enzymklyvningsstället och introducera nästa DNA-fragment nedströms DNA-fragmentet uppströms.

Det introducerade restriktionsenzymklyvningsstället i 3'-änden av uppströms DNA-fragmentet kommer att elimineras, och ett nytt klyvningsställe kommer att introduceras i 3'-änden av nedströms DNA-fragmentet. På så sätt kan vi sammanfoga DNA-fragment till vektorn ett efter ett. Den här metoden kan användas för att konstruera PRRSV-uttrycksvektorn och är en effektiv metod för att montera ett stort antal fragment i uttrycksvektorn.