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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A tradução dos achados da microscopia intravital é desafiada por sua penetração em profundidade rasa no tecido. Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com câmara de janela dorsal que permite o co-registro de microscopia intravital e modalidades de imagem clinicamente aplicáveis (por exemplo, TC, RM) para correlação espacial direta, potencialmente simplificando a tradução clínica dos achados da microscopia intravital.

Abstract

Imagens intravitais pré-clínicas, como microscopia e tomografia de coerência óptica, provaram ser ferramentas valiosas na pesquisa do câncer para visualizar o microambiente tumoral e sua resposta à terapia. Essas modalidades de imagem têm resolução em escala de mícron, mas têm uso limitado na clínica devido à sua profundidade de penetração rasa no tecido. Modalidades de imagem mais clinicamente aplicáveis, como TC, RM e PET, têm profundidade de penetração muito maior, mas têm resolução espacial comparativamente menor (escala de mm).

Para traduzir os achados de imagem intravital pré-clínica para a clínica, novos métodos devem ser desenvolvidos para preencher essa lacuna de resolução micro a macro . Aqui, descrevemos um modelo de camundongo com tumor de câmara de janela de dobra cutânea dorsal projetado para permitir imagens intravitais pré-clínicas e clinicamente aplicáveis (TC e RM) no mesmo animal, e a plataforma de análise de imagem que liga esses dois métodos de visualização díspares. É importante ressaltar que a abordagem da câmara de janela descrita permite que as diferentes modalidades de imagem sejam co-registradas em 3D usando marcadores fiduciais na câmara da janela para concordância espacial direta. Este modelo pode ser usado para validação de métodos de imagem clínica existentes, bem como para o desenvolvimento de novos por meio de correlação direta com achados intravitais de alta resolução "ground truth".

Finalmente, a resposta do tumor a vários tratamentos - quimioterapia, radioterapia, terapia fotodinâmica - pode ser monitorada longitudinalmente com esta metodologia usando modalidades de imagem pré-clínicas e clinicamente aplicáveis. O modelo de camundongo de tumor de câmara de dobra cutânea dorsal e as plataformas de imagem descritas aqui podem, portanto, ser usados em uma variedade de estudos de pesquisa de câncer, por exemplo, na tradução de achados de microscopia intravital pré-clínica para modalidades de imagem mais clinicamente aplicáveis, como tomografia computadorizada ou ressonância magnética.

Introduction

A microvasculatura tumoral é um componente importante do microambiente tumoral que pode ser um alvo para terapia e um determinante da resposta ao tratamento. No cenário pré-clínico, a microvasculatura é tipicamente estudada usando microscopia intravital em modelos animais ortotópicos ou heterotópicos de câmara de janela 1,2. Isso tem várias vantagens em relação aos estudos histológicos, uma vez que a imagem é feita em tecidos vivos e o tumor pode ser monitorado longitudinalmente por várias semanas ou até meses 2,3. Esses estudos podem aproveitar os rec....

Protocol

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais, estabelecido pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais. Os experimentos foram realizados de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da University Health Network em Toronto, Canadá.

1. Marcação de inoculação de tumor

NOTA: "Landmarking" refere-se ao processo de marcação da p.......

Representative Results

A tomografia de coerência óptica de variância de speckle (svOCT) foi realizada para obter imagens microvasculares 3D de grande campo de visão (FOV) (6 x 6 mm,2 laterais x 1 mm de profundidade). Para obter essas imagens, foi utilizado um sistema OCT de fonte varrida previamente descrito baseado em um interferômetro de quadratura23. As imagens de OCT foram adquiridas pela junção de duas varreduras de 3 x 6 mm2 FOV adjacentes lateralmente. Cada B-scan consistiu em 400 A-s.......

Discussion

Neste trabalho, desenvolvemos um fluxo de trabalho para realizar microscopia intravital e imagens clinicamente aplicáveis (TC, RM e PET) no mesmo animal. Isso foi feito com o objetivo de traduzir os achados da microscopia pré-clínica para a clínica por correlação direta da microscopia intravital com modalidades de imagem clínica, como ressonância magnética. Embora os designs convencionais do DSFC sejam feitos de metal 2,3, adaptamos o DSFC para ser compa.......

Acknowledgements

Agradecemos à Dra. Carla Calçada (pós-doutoranda, Princess Margaret Cancer Centre) e ao Dr. Timothy Samuel (Ph.D. Student, Princess Margaret Cancer Center) pela ajuda na cultura de células tumorais e no desenvolvimento do protocolo de inoculação. A Dra. Kathleen Ma, a Dra. Anna Pietraszek e a Dra. Alyssa Goldstein (Animal Research Centre, Princess Margaret Cancer Center) ajudaram no desenvolvimento do protocolo de cirurgia. Jacob Broske (Tecnólogo de Engenharia Médica, Princess Margaret Cancer Center) e Wayne Keller (Executivo de Clientes de Hardware, Javelin Technologies – Uma Empresa do Grupo TriMech) imprimiram em 3D as câmaras das janelas. James Jonkman (Advanced ....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Materials
BxPC-3 Human Pancreatic Cancer CellsATCC (American Type Culture Collection)CRL-1687
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mLCorning354234
Corning Stripettor Ultra Pipet ControllerCorning07-202-350
Dulbecco Phospphate buffered saline without Calcium, Magnesium, or phenol red, 500 mLGibco14190144
Fetal Bovine Serum (Canada), 500 mLSigma-AldrichF1051-500ML
Penicillin-Streptomycin 100x (liquid,stabilized, sterile-filtered, cell culture tested)Sigma-AldrichP4333-100ML
RPMI Medium 1640 (1x), liquid; with L-Glutamine, 500 mLGibco11875093
TrypLE Express Enzyme, 500 mLGibco12605028
Window Chamber Materials
12 mm Glass CoverslipHarvard Apparatus  CS-12R No. 1.5
Connex 500 3D PrinterStratasysN/A
Biocompatible clear MED610 resinStratasys RGD810
Loctite AA 3105 UV curable glueLoctiteLCT1214249
Window chamber back frameTrimech IncN/A
Window chamber fiducial markerTrimech IncN/A
Window Chamber front frameTrimech IncN/A
Window chamber support clipTrimech IncN/A
inoculation and Surgery Materials
BD SafetyGlide Insulin Syringes with Permanently Attached Needles, 0.5 mL, 29 G x 1/2"BDCABD305932
Betadine SolutionBetadineAP-B002C2R98U
Cidex OPA 14 Day Solution 3.8 LASPJOH20394
Disposable Surgical Underpads 23 inch x 24 inchKendall7134
Eye lubricant  Optixcare50-218-8442
Hair removal creamNair‎061700222611
Halstead Hemostatic ForcepsAlmedic7742-A12-150
Heating padSunbeam B086MCN59R
Iris ScissorsAlmedic7601-A8-690
IsofluraneSigma792632
Metacam Boehringer Ingelheim Animal Health USA IncNDC 0010-6015-03
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ mousethe Jackson laboratory7799
Peanut Clipper & TrimmerWahl8655-200
 SOFSILK Nonabsorbable Surgical Suture #5-0 with 3/8" Taper point needle (17 mm) (Wax Coated,Braided Black Silk, Sterile)  Syneture  VS880
Splinter ForcepsAlmedic7725-A10-634
MR Imaging
3D printed window chamber immobilization device.custom 3D printed, refer to figure 3 for details.
Convection heating device3M Bair Hugger70200791401
Drug injection systemHarvard Apparatus  PY2 70-2131PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump
Gadovist 1.0Bayer2241089
Respiratory monitoring systemSAIIModel 1030MR-compatible monitoring and gating system for small animals.
Tail vein catheter (27 G 0.5" )Terumo Medical Corp15253
Optical Imaging
3D printed imaging stageCustom 3D printed, refer to supplementary figure 3 for details.
12 V 7 W Flexible Polyimide Heater Plate Thin Adhesive PI Heating Film 25 mm x 50 mmBANRIA B09X16XCVSHeating element used for mouse body temeprature regulation.
DC power supplyBK Precission1761Used to power the heating element.
Leica MZ FLIIILeica Microsystems15209
svOCT imaging systemIn-house made imaging system. Details can be found in reference 23.
Software
MATLAB SoftwareMathWorksR2020A

References

  1. Fukumura, D., Duda, D. G., Munn, L. L., Jain, R. K. Tumor microvasculature and microenvironment: Novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17 (3), 206-225 (2010).
  2. Demidov, V., et al.

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