בידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות בדיקת שמרים דו-היברידית

Summary

האינטראקציות של ביומולקולות, כגון אינטראקציות חלבון-חלבון, הן הבסיס המולקולרי של פונקציות ביולוגיות. אם ניתן לבודד מוטנטים ריקים/לקויים שחסרים באופן ספציפי את האינטראקציה הרלוונטית, הם יעזרו מאוד להבין את הפונקציות של אינטראקציה זו. מאמר זה מציג דרך יעילה לבודד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה.

Abstract

אינטראקציות חלבון-חלבון הן אחד התהליכים הבסיסיים ביותר העומדים בבסיס תופעות ביולוגיות. אחת הדרכים הפשוטות והטובות ביותר להבין את התפקיד(ים) והתפקוד(ים) של אינטראקציה חלבון-חלבון ספציפית היא להשוות את הפנוטיפ של סוג הבר (עם האינטראקציה הרלוונטית בין חלבון לחלבון) לבין אלה של מוטנטים חסרי האינטראקציה הרלוונטית. לכן, אם מוטנטים כאלה יכולים להיות מבודדים, הם יסייעו להבהיר את התהליכים הביולוגיים הקשורים. הליך השמרים הדו-היברידי (Y2H) הוא גישה רבת עוצמה לא רק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון, אלא גם לבידוד מוטציות ריקות/לקויות אינטראקציה. במאמר זה, מוצג פרוטוקול לבידוד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות טכנולוגיית Y2H. ראשית, ספריית מוטציות נבנית על ידי שילוב של תגובת שרשרת פולימראז וטכנולוגיית שיבוט חלקה יעילה, אשר מוציאה ביעילות את הווקטור הריק מהספרייה. שנית, מוטנטים אינטראקציה-אפס/לקויים נבדקים על ידי מבחן Y2H. בגלל טריק בווקטור Y2H, מוטציות לא רצויות, כמו אלה עם מוטציות frameshift ושטויות, מסולקות ביעילות מתהליך הסינון. אסטרטגיה זו היא פשוטה ולכן ניתן ליישם אותה על כל שילוב של חלבונים שהאינטראקציה ביניהם יכולה להיות מזוהה על ידי המערכת הדו-היברידית.

Introduction

אינטראקציות בין ביומולקולות הן החלק הבסיסי ביותר של תופעות ביולוגיות. אינטראקציות חלבון-חלבון מהוות חלק משמעותי מאינטראקציות כאלה. לכן, זיהוי של שותפי האינטראקציה של חלבון מעניין הוא קריטי כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציה של החלבון/גן המעניין. שיטת השמרים הדו-היברידיים (Y2H) היא טכניקה פופולרית לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון in vivo¹. במערכת זו, שני חלבונים (X ו-Y) שהאינטראקציה ביניהם אמורה להיבדק מאוחים לתחום קשירת הדנ"א (DB) ולתחום הפעלת השעתוק (AD), בהתאמה. חלבון ההיתוך DB-X נקשר לרצף זיהוי של תחום DB; לכן, כאשר חלבונים X ו-Y מתקשרים, חלבון ההיתוך AD-Y מגיע לקרבת רצף הזיהוי. כתוצאה מכך, מופעל שעתוק של גן המדווח במורד הזרם של רצף הזיה....

Protocol

1. בניית הספרייה המוטנטית

1. הגדר את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) (דוגמה מוצגת להלן). בדרך כלל, להכין 50 μL של התגובה, אשר מחולק עשרה aliquots של 5 μL, ולהגביר את מקטע גן המטרה במכונת PCR⁴.
   הערה: על המשתמשים לבחור פולימראז מתאים כדי להציג מוטציות ביעילות. אם מקטע הדנ"א שיש להגביר ה?.......

Discussion

מאמר זה מתאר כיצד לבודד מוטנטים ריקים/לקויים באמצעות מבחן Y2H. מוטנטים כאלה הם כלים רבי עוצמה לנתח את הפונקציה של חלבון מעניין. כדי לבודד מוטנטים כאלה, בדיקות rY2H פותחו בעבר על ידי שינוי זן המאכסן Y2H ^2,3. עם זאת, הם לא הפחיתו מאוד את כמות העבודה. לעומת זאת, ניתן לבו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (8.0)	Nacalai Tesque Inc.	14347-21
10% SDS Solution	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	313-90275
2-mercaptoethanol	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	135-07522
2-propanol	Kishida Chemical Co. Ltd.	110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	021-07852
Agar	Formedium	AGR60
Ampicillin Sodium	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.	M180-7
DNA from salmon testes	Merck KGaA.	D1626
Ethanol	Merck KGaA.	9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)	Whatman, Cytiva	1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	00011150
G-418 Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	075-05962
Hydrochloric acid	Kishida Chemical Co. Ltd.	230-37585
KCl	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	163-03545
Lithium Acetate Dihydrate	Nacalai Tesque Inc.	20604-22
MgSO4•7H2O	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	131-00405
Na2HPO4•12H2O	Nacalai Tesque Inc.	10039-32-4
NaCl	Nacalai Tesque Inc.	31319-45
NaH2PO4•2H2O	Nacalai Tesque Inc.	31717-25
Paper towel	AS ONE Corp.	7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	Nacalai Tesque Inc.	25970-56
Plasmid DNAs	the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation Kit	Nippon Genetics Co. Ltd.	FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000	Nacalai Tesque Inc.	11574-15
SC double drop-out mix -Leu -Trp	Formedium	DSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )	Takara Bio Inc.	#639648
Skim milk powder	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	190-12865
Streptomycin Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)	Promega Corp.	M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane	Formedium	TRIS01
Triton X-100	Nacalai Tesque Inc.	12967-45
Tryptone	ThermoFisher scientific Inc.	211705
Tween 20	Nacalai Tesque Inc.	35624-15
Yeast Extract	ThermoFisher scientific Inc.	212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)	Formedium	CYN0210
Zymolyase 100T	Nacalai Tesque Inc.	07665-55