Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Summary

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Abstract

As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.

Introduction

As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo¹. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A prot....

Protocol

1. Construção da biblioteca mutante

1. Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR⁴.
   NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de.......

Discussion

Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H ^2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significat.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (8.0)	Nacalai Tesque Inc.	14347-21
10% SDS Solution	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	313-90275
2-mercaptoethanol	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	135-07522
2-propanol	Kishida Chemical Co. Ltd.	110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	021-07852
Agar	Formedium	AGR60
Ampicillin Sodium	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.	M180-7
DNA from salmon testes	Merck KGaA.	D1626
Ethanol	Merck KGaA.	9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)	Whatman, Cytiva	1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	00011150
G-418 Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	075-05962
Hydrochloric acid	Kishida Chemical Co. Ltd.	230-37585
KCl	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	163-03545
Lithium Acetate Dihydrate	Nacalai Tesque Inc.	20604-22
MgSO4•7H2O	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	131-00405
Na2HPO4•12H2O	Nacalai Tesque Inc.	10039-32-4
NaCl	Nacalai Tesque Inc.	31319-45
NaH2PO4•2H2O	Nacalai Tesque Inc.	31717-25
Paper towel	AS ONE Corp.	7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	Nacalai Tesque Inc.	25970-56
Plasmid DNAs	the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation Kit	Nippon Genetics Co. Ltd.	FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000	Nacalai Tesque Inc.	11574-15
SC double drop-out mix -Leu -Trp	Formedium	DSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )	Takara Bio Inc.	#639648
Skim milk powder	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	190-12865
Streptomycin Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)	Promega Corp.	M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane	Formedium	TRIS01
Triton X-100	Nacalai Tesque Inc.	12967-45
Tryptone	ThermoFisher scientific Inc.	211705
Tween 20	Nacalai Tesque Inc.	35624-15
Yeast Extract	ThermoFisher scientific Inc.	212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)	Formedium	CYN0210
Zymolyase 100T	Nacalai Tesque Inc.	07665-55