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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Abstract

As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.

Introduction

As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo1. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A prot....

Protocol

1. Construção da biblioteca mutante

  1. Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR4.
    NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de.......

Representative Results

Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o mé.......

Discussion

Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H 2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significat.......

Acknowledgements

Y. Tanaka realizou o aprimoramento técnico do Y2H. Este trabalho é apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 e pelo Institute for Fermentation, Osaka.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS SolutionFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoethanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanolKishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
AgarFormediumAGR60
Ampicillin SodiumFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT  Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.M180-7
DNA from salmon testesMerck KGaA.D1626
EthanolMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)Whatman, Cytiva1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.00011150
G-418 SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Hydrochloric acidKishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Lithium Acetate DihydrateNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4•7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4•12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4•2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Paper towelAS ONE Corp.7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
Plasmid DNAsthe National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation KitNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC double drop-out mix -Leu -TrpFormediumDSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )Takara Bio Inc.#639648
Skim milk powderFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Streptomycin SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethaneFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TryptoneThermoFisher scientific Inc.211705
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Yeast ExtractThermoFisher scientific Inc.212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A gen....

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