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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Abstract

As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.

Introduction

As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo1. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A prot....

Protocol

1. Construção da biblioteca mutante

  1. Configure a reação em cadeia da polimerase (PCR) (um exemplo é mostrado abaixo). Geralmente, preparar 50 μL da reação, que é dividida em dez alíquotas de 5 μL, e amplificar o fragmento do gene alvo em uma máquina de PCR4.
    NOTA: Os usuários devem selecionar uma polimerase apropriada para introduzir mutações com eficiência. Se o fragmento de DNA a ser amplificado for curto, é necessária uma polimerase com uma taxa de.......

Representative Results

Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o mé.......

Discussion

Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H 2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significat.......

Disclosures

Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Acknowledgements

Y. Tanaka realizou o aprimoramento técnico do Y2H. Este trabalho é apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 e pelo Institute for Fermentation, Osaka.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS SolutionFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoethanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanolKishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
AgarFormediumAGR60
Ampicillin SodiumFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT  Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.M180-7
DNA from salmon testesMerck KGaA.D1626
EthanolMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)Whatman, Cytiva1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.00011150
G-418 SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Hydrochloric acidKishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Lithium Acetate DihydrateNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4•7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4•12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4•2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Paper towelAS ONE Corp.7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
Plasmid DNAsthe National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation KitNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC double drop-out mix -Leu -TrpFormediumDSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )Takara Bio Inc.#639648
Skim milk powderFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Streptomycin SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethaneFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TryptoneThermoFisher scientific Inc.211705
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Yeast ExtractThermoFisher scientific Inc.212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A gen....

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