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As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.
As interações proteína-proteína são um dos processos mais básicos subjacentes aos fenômenos biológicos. Uma das maneiras mais simples e melhores de entender o (s) papel (s) e a (s) função (ões) de uma interação proteína-proteína específica é comparar o fenótipo do tipo selvagem (com a interação proteína-proteína relevante) e os de mutantes que não possuem a interação relevante. Portanto, se tais mutantes puderem ser isolados, eles ajudarão a elucidar os processos biológicos relacionados. O procedimento de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma abordagem poderosa não apenas para detectar interações proteína-proteína, mas também para isolar mutantes de interação nula/prejudicada. Neste artigo, é apresentado um protocolo para isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando a tecnologia Y2H. Primeiro, uma biblioteca de mutações é construída combinando a reação em cadeia da polimerase e a tecnologia eficiente de clonagem contínua, que exclui eficientemente o vetor vazio da biblioteca. Em segundo lugar, mutantes de interação nula/prejudicada são rastreados pelo ensaio Y2H. Por causa de um truque no vetor Y2H, mutantes indesejados, como aqueles com mudanças de quadro e mutações sem sentido, são eliminados com eficiência do processo de triagem. Essa estratégia é simples e pode, portanto, ser aplicada a qualquer combinação de proteínas cuja interação possa ser detectada pelo sistema de dois híbridos.
As interações entre biomoléculas são a parte mais básica dos fenômenos biológicos. As interações proteína-proteína constituem uma parte significativa de tais interações. Portanto, a identificação do(s) parceiro(s) de interação de uma proteína de interesse é fundamental para elucidar ainda mais a função da proteína/gene de interesse. O método de dois híbridos de levedura (Y2H) é uma técnica popular para identificar interações proteína-proteína in vivo1. Nesse sistema, duas proteínas (X e Y) cuja interação deve ser testada são fundidas ao domínio de ligação ao DNA (DB) e ao domínio de ativação transcricional (AD), respectivamente. A prot....
1. Construção da biblioteca mutante
Recentemente, descobriu-se que a metade C-terminal da proteína Pol2 (Pol2-C) interage com Mcm10. Ambas as proteínas são essenciais para o início da replicação do DNA e, portanto, para o crescimento celular na levedura Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Para ajudar a entender o significado biológico dessa interação, os mutantes Pol2-C que não têm interação / diminuição com Mcm10 foram isolados usando o mé.......
Este artigo descreve como isolar mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio Y2H. Esses mutantes são ferramentas poderosas para analisar a função de uma proteína de interesse. Para isolar tais mutantes, ensaios de rY2H foram desenvolvidos anteriormente, modificando a cepa hospedeira Y2H 2,3. No entanto, eles não reduziram muito a quantidade de trabalho. Por outro lado, os mutantes podem ser isolados com este método sem uma quantidade significat.......
Y. Tanaka realizou o aprimoramento técnico do Y2H. Este trabalho é apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number JP22K06336 e pelo Institute for Fermentation, Osaka.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
10% SDS Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
2-mercaptoethanol | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
2-propanol | Kishida Chemical Co. Ltd. | 110-64785 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
Agar | Formedium | AGR60 | |
Ampicillin Sodium | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT | Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. | M180-7 | |
DNA from salmon testes | Merck KGaA. | D1626 | |
Ethanol | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
Filter paper for colony lift (Grade 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
Filter paper for colony lift (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 01411090 | |
Filter paper for replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 00011150 | |
G-418 Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
Hydrochloric acid | Kishida Chemical Co. Ltd. | 230-37585 | |
KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
Lithium Acetate Dihydrate | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
MgSO4•7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
Na2HPO4•12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
NaH2PO4•2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
Paper towel | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
Plasmid DNAs | the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
Plasmid isolation Kit | Nippon Genetics Co. Ltd. | FG-90502 | |
Polyethylene Glycol #4,000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
SC double drop-out mix -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
Skim milk powder | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
Streptomycin Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane | Formedium | TRIS01 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
Tryptone | ThermoFisher scientific Inc. | 211705 | |
Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
Yeast Extract | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base (YNB) | Formedium | CYN0210 | |
Zymolyase 100T | Nacalai Tesque Inc. | 07665-55 |
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