A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.
Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.
Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo1. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответств....
1. Построение библиотеки мутантов
Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понят.......
В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификац.......
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Ю. Танака выполнил техническое усовершенствование Y2H. Эта работа поддерживается грантом JSPS KAKENHI No JP22K06336 и Институтом ферментации в Осаке.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
10% SDS Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
2-mercaptoethanol | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
2-propanol | Kishida Chemical Co. Ltd. | 110-64785 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
Agar | Formedium | AGR60 | |
Ampicillin Sodium | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT | Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. | M180-7 | |
DNA from salmon testes | Merck KGaA. | D1626 | |
Ethanol | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
Filter paper for colony lift (Grade 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
Filter paper for colony lift (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 01411090 | |
Filter paper for replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 00011150 | |
G-418 Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
Hydrochloric acid | Kishida Chemical Co. Ltd. | 230-37585 | |
KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
Lithium Acetate Dihydrate | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
MgSO4•7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
Na2HPO4•12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
NaH2PO4•2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
Paper towel | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
Plasmid DNAs | the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
Plasmid isolation Kit | Nippon Genetics Co. Ltd. | FG-90502 | |
Polyethylene Glycol #4,000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
SC double drop-out mix -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
Skim milk powder | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
Streptomycin Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane | Formedium | TRIS01 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
Tryptone | ThermoFisher scientific Inc. | 211705 | |
Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
Yeast Extract | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base (YNB) | Formedium | CYN0210 | |
Zymolyase 100T | Nacalai Tesque Inc. | 07665-55 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved