Выделение мутантов Interaction-Null/Impairment с помощью двухгибридного анализа дрожжей

Summary

Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.

Introduction

Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo¹. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответств....

Protocol

1. Построение библиотеки мутантов

1. Настройте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (пример приведен ниже). Как правило, готовят 50 мкл реакции, которую делят на десять аликвот по 5 мкл, и амплифицируют фрагмент гена-мишени в ПЦР-машине⁴.
   Примечание: Пользователи долж.......

Discussion

В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификац.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA (8.0)	Nacalai Tesque Inc.	14347-21
10% SDS Solution	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	313-90275
2-mercaptoethanol	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	135-07522
2-propanol	Kishida Chemical Co. Ltd.	110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	021-07852
Agar	Formedium	AGR60
Ampicillin Sodium	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT	Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.	M180-7
DNA from salmon testes	Merck KGaA.	D1626
Ethanol	Merck KGaA.	9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)	Whatman, Cytiva	1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)	Advantec Toyo Kaisha, Ltd.	00011150
G-418 Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	075-05962
Hydrochloric acid	Kishida Chemical Co. Ltd.	230-37585
KCl	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	163-03545
Lithium Acetate Dihydrate	Nacalai Tesque Inc.	20604-22
MgSO4•7H2O	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	131-00405
Na2HPO4•12H2O	Nacalai Tesque Inc.	10039-32-4
NaCl	Nacalai Tesque Inc.	31319-45
NaH2PO4•2H2O	Nacalai Tesque Inc.	31717-25
Paper towel	AS ONE Corp.	7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	Nacalai Tesque Inc.	25970-56
Plasmid DNAs	the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation Kit	Nippon Genetics Co. Ltd.	FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000	Nacalai Tesque Inc.	11574-15
SC double drop-out mix -Leu -Trp	Formedium	DSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )	Takara Bio Inc.	#639648
Skim milk powder	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	190-12865
Streptomycin Sulfate	Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.	3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)	Promega Corp.	M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane	Formedium	TRIS01
Triton X-100	Nacalai Tesque Inc.	12967-45
Tryptone	ThermoFisher scientific Inc.	211705
Tween 20	Nacalai Tesque Inc.	35624-15
Yeast Extract	ThermoFisher scientific Inc.	212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)	Formedium	CYN0210
Zymolyase 100T	Nacalai Tesque Inc.	07665-55