A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.
Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.
Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo1. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответств....
1. Построение библиотеки мутантов
Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понят.......
В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификац.......
Ю. Танака выполнил техническое усовершенствование Y2H. Эта работа поддерживается грантом JSPS KAKENHI No JP22K06336 и Институтом ферментации в Осаке.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.5 M EDTA (8.0) | Nacalai Tesque Inc. | 14347-21 | |
10% SDS Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 313-90275 | |
2-mercaptoethanol | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 135-07522 | |
2-propanol | Kishida Chemical Co. Ltd. | 110-64785 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 021-07852 | |
Agar | Formedium | AGR60 | |
Ampicillin Sodium | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 68-52-3 | |
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT | Medical & Biological Laboratories Co. Ltd. | M180-7 | |
DNA from salmon testes | Merck KGaA. | D1626 | |
Ethanol | Merck KGaA. | 9-0770-4-4L-J | |
Filter paper for colony lift (Grade 50) | Whatman, Cytiva | 1450-090 | |
Filter paper for colony lift (No.4A) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 01411090 | |
Filter paper for replicaplating (No.1) | Advantec Toyo Kaisha, Ltd. | 00011150 | |
G-418 Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 075-05962 | |
Hydrochloric acid | Kishida Chemical Co. Ltd. | 230-37585 | |
KCl | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 163-03545 | |
Lithium Acetate Dihydrate | Nacalai Tesque Inc. | 20604-22 | |
MgSO4•7H2O | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 131-00405 | |
Na2HPO4•12H2O | Nacalai Tesque Inc. | 10039-32-4 | |
NaCl | Nacalai Tesque Inc. | 31319-45 | |
NaH2PO4•2H2O | Nacalai Tesque Inc. | 31717-25 | |
Paper towel | AS ONE Corp. | 7-6200-02 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | Nacalai Tesque Inc. | 25970-56 | |
Plasmid DNAs | the National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml) | ||
Plasmid isolation Kit | Nippon Genetics Co. Ltd. | FG-90502 | |
Polyethylene Glycol #4,000 | Nacalai Tesque Inc. | 11574-15 | |
SC double drop-out mix -Leu -Trp | Formedium | DSCK172 | |
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly ) | Takara Bio Inc. | #639648 | |
Skim milk powder | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 190-12865 | |
Streptomycin Sulfate | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 3810-74-0 | |
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes) | Promega Corp. | M7122 | |
TRIS (hydroxymethyl) aminomethane | Formedium | TRIS01 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque Inc. | 12967-45 | |
Tryptone | ThermoFisher scientific Inc. | 211705 | |
Tween 20 | Nacalai Tesque Inc. | 35624-15 | |
Yeast Extract | ThermoFisher scientific Inc. | 212750 | |
Yeast Nitrogen Base (YNB) | Formedium | CYN0210 | |
Zymolyase 100T | Nacalai Tesque Inc. | 07665-55 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved