Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.

Abstract

Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.

Introduction

Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo1. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответств....

Protocol

1. Построение библиотеки мутантов

  1. Настройте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (пример приведен ниже). Как правило, готовят 50 мкл реакции, которую делят на десять аликвот по 5 мкл, и амплифицируют фрагмент гена-мишени в ПЦР-машине4.
    Примечание: Пользователи долж.......

Representative Results

Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понят.......

Discussion

В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификац.......

Acknowledgements

Ю. Танака выполнил техническое усовершенствование Y2H. Эта работа поддерживается грантом JSPS KAKENHI No JP22K06336 и Институтом ферментации в Осаке.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 M EDTA (8.0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% SDS SolutionFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-mercaptoethanolFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-propanolKishida Chemical Co. Ltd.110-64785
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
AgarFormediumAGR60
Ampicillin SodiumFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Anti-HA-tag mAb-HRP-DirecT  Medical & Biological Laboratories Co. Ltd.M180-7
DNA from salmon testesMerck KGaA.D1626
EthanolMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Filter paper for colony lift (Grade 50)Whatman, Cytiva1450-090
Filter paper for colony lift (No.4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.01411090
Filter paper for replicaplating (No.1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.00011150
G-418 SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Hydrochloric acidKishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Lithium Acetate DihydrateNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4•7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4•12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4•2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Paper towelAS ONE Corp.7-6200-02
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1Nacalai Tesque Inc.25970-56
Plasmid DNAsthe National BioResource Project - yeast (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Plasmid isolation KitNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Polyethylene Glycol #4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC double drop-out mix -Leu -TrpFormediumDSCK172
Seamless cloning kit (In-Fusion assembly )Takara Bio Inc.#639648
Skim milk powderFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Streptomycin SulfateFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq polymerase (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (hydroxymethyl) aminomethaneFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
TryptoneThermoFisher scientific Inc.211705
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Yeast ExtractThermoFisher scientific Inc.212750
Yeast Nitrogen Base (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55

References

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A gen....

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved