DNAzyme 10-23 - Nanomacchine basate sul riconoscimento degli acidi nucleici

Summary

Le nanomacchine basate su DNAzyme possono essere utilizzate per il rilevamento altamente selettivo e sensibile degli acidi nucleici. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per la progettazione di nanomacchine basate su DNAzyme con un nucleo 10-23 utilizzando software libero e la loro applicazione nel rilevamento di un frammento di virus di Epstein-Barr come esempio.

Abstract

Le nanomacchine basate su DNAzimi (DNM) per la rilevazione di sequenze di DNA e RNA (analiti) sono strutture multifunzionali costituite da oligonucleotidi. Le loro funzioni includono lo stretto legame dell'analita, il riconoscimento altamente selettivo dell'analita, l'amplificazione del segnale fluorescente mediante molteplici scissioni catalitiche di un substrato reporter fluorogenico e l'attrazione del substrato fluorogenico per un aumento della risposta del sensore. Le unità funzionali sono attaccate a un'impalcatura comune di DNA per la loro azione cooperativa. I DNM 10-23 con scissione dell'RNA presentano una sensibilità migliorata rispetto alle sonde di ibridazione non catalitica. La stabilità del DNM e le maggiori possibilità di riconoscimento del substrato sono fornite da un frammento di DNA a doppio filamento, una piastrella. DNM è in grado di differenziare due analiti con una differenza di singolo nucleotide in un RNA ripiegato e in un DNA a doppio filamento e rilevare analiti a concentrazioni ~1000 volte inferiori rispetto ad altre sonde di ibridazione senza proteine. Questo articolo presenta il concetto alla base del potenziale diagnostico dell'attività delle nanomacchine a DNA e una panoramica della progettazione, dell'assemblaggio e dell'applicazione del DNM nei saggi di rilevamento degli acidi nucleici.

Introduction

Uno dei primi metodi per la rilevazione dell'acido nucleico è il legame complementare di oligonucleotidi selettivi alle sequenze di RNA o DNA analizzate. Questo metodo impiega frammenti di acido nucleico (sonde) che possono formare coppie di basi di Watson-Crick con un analita di DNA o RNA¹ mirato. Il complesso viene quindi differenziato dall'analita e dalla sonda non legata mediante una varietà di tecniche. Alcuni metodi, come il Northern blotting, l'ibridazione in situ o qPCR, si basano sul fenomeno del legame complementare². Le sonde di ibridazione più comuni presentano due s....

Protocol

1. Progettazione DNM

1. Seleziona una regione unica all'interno del genoma di interesse.
   NOTA: Questo lavoro utilizza una regione del genoma del virus di Epstein-Barr (EBV) nelle posizioni 13972-14154 (OR652423.1).
2. Crea un set di primer per l'amplificazione del frammento selezionato, ad esempio, tramite lo strumento Primer3 incorporato in Ugene²⁶.
3. Aprire lo strumento web UNAFold²⁷ (ved.......

Discussion

La progettazione di macchine per DNA è semplice, ma richiede una certa esperienza nella progettazione di sonde di ibridazione o nanostrutture funzionali di DNA. È opportuno mantenere il frammento dell'analita il più corto possibile per ridurre il numero di possibili strutture secondarie e semplificare l'invasione del DNM alla struttura secondaria. Il contenuto di CG dovrebbe essere preferibilmente inferiore al 60% per evitare strutture intramolecolari stabili. Il corretto assemblaggio.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification