DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas baseadas para reconhecimento de ácidos nucleicos

Summary

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme podem ser usadas para detecção altamente seletiva e sensível de ácidos nucléicos. Este artigo descreve um protocolo detalhado para o projeto de nanomáquinas baseadas em DNAzyme com um núcleo 10-23 usando software livre e sua aplicação na detecção de um fragmento de vírus Epstein-Barr como exemplo.

Abstract

As nanomáquinas baseadas em DNAzyme (DNM) para a detecção de sequências de DNA e RNA (analitos) são estruturas multifuncionais feitas de oligonucleotídeos. Suas funções incluem ligação apertada do analito, reconhecimento altamente seletivo do analito, amplificação de sinal fluorescente por múltiplas clivagens catalíticas de um substrato repórter fluorogênico e atração de substrato fluorogênico para um aumento na resposta do sensor. As unidades funcionais são anexadas a um andaime de DNA comum para sua ação cooperativa. Os DNMs 10-23 de clivagem de RNA apresentam sensibilidade aprimorada em comparação com sondas de hibridização não catalíticas. A estabilidade do DNM e o aumento das chances de reconhecimento do substrato são fornecidos por um fragmento de DNA de fita dupla, um ladrilho. O DNM pode diferenciar dois analitos com uma única diferença de nucleotídeo em um RNA dobrado e um DNA de fita dupla e detectar analitos em concentrações ~ 1000 vezes menores do que outras sondas de hibridização livre de proteínas. Este artigo apresenta o conceito por trás do potencial diagnóstico da atividade da DNA-nanomáquina e apresenta uma visão geral do projeto, montagem e aplicação do DNM em ensaios de detecção de ácido nucleico.

Introduction

Um dos primeiros métodos para detecção de ácidos nucleicos é a ligação complementar de oligonucleotídeos seletivos às sequências de RNA ou DNA analisadas. Este método emprega fragmentos de ácido nucleico (sondas) que podem formar pares de bases Watson-Crick com um analito de DNA ou RNA direcionado¹. O complexo é então diferenciado do analito e da sonda não ligada por uma variedade de técnicas. Certos métodos, como Northern blotting, hibridização in situ ou qPCR, são baseados no fenômeno da ligação complementar². As sondas de hibridização mais comuns têm duas desvantagens signifi....

Protocol

1. Projeto de DNM

1. Selecione uma região única dentro do genoma de interesse.
   NOTA: Este trabalho usa uma região do genoma do vírus Epstein-Barr (EBV) nas posições 13972-14154 (OR652423.1).
2. Crie um conjunto de primers para a amplificação do fragmento selecionado, por exemplo, por meio da ferramenta Primer3 incorporada no Ugene²⁶.
3. Abra a ferramenta da web UNAFold²⁷ (consulte

Discussion

O projeto de máquinas de DNA é simples, mas requer alguma experiência no projeto de sondas de hibridização ou nanoestruturas funcionais de DNA. É apropriado manter o fragmento do analito o mais curto possível para diminuir o número de possíveis estruturas secundárias e simplificar a invasão do DNM à estrutura secundária. O conteúdo de CG deve ser preferencialmente inferior a 60% para evitar estruturas intramoleculares estáveis. A montagem bem-sucedida do DNM é alcançada .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification