DNAzyme 10-23 - Наномашины для распознавания нуклеиновых кислот

Summary

Наномашины на основе ДНКферментов могут быть использованы для высокоселективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В данной статье описан подробный протокол проектирования наномашин на основе ДНКферментов с ядром 10-23 с использованием свободного программного обеспечения и их применение при обнаружении фрагмента вируса Эпштейна-Барр в качестве примера.

Abstract

Наномашины на основе ДНК (DNM) для обнаружения последовательностей ДНК и РНК (аналитов) представляют собой многофункциональные структуры, изготовленные из олигонуклеотидов. Их функции включают плотное связывание аналита, высокоселективное распознавание аналита, усиление флуоресцентного сигнала путем многократного каталитического расщепления флуорогенной репортерной подложки и притяжение флуорогенной подложки для увеличения отклика сенсора. Функциональные единицы прикрепляются к общему каркасу ДНК для их совместного действия. ДНК, расщепляющие РНК 10-23, отличаются повышенной чувствительностью по сравнению с некаталитическими гибридизационными зондами. Стабильность DNM и повышенные шансы распознавания субстрата обеспечиваются двухцепочечным фрагментом ДНК – плиткой. DNM может дифференцировать два аналита с разницей в одном нуклеотиде в свернутой РНК и двухцепочечной ДНК и обнаруживать аналиты в концентрациях в ~1000 раз ниже, чем у других зондов безбелковой гибридизации. В данной статье представлена концепция, лежащая в основе диагностического потенциала активности ДНК-наномашин, а также рассмотрены разработка, сборка и применение ДНК в анализах детекции нуклеиновых кислот.

Introduction

Одним из самых ранних методов обнаружения нуклеиновых кислот является комплементарное связывание селективных олигонуклеотидов с анализируемыми последовательностями РНК или ДНК. В этом методе используются фрагменты нуклеиновых кислот (зонды), которые могут образовывать пары оснований Уотсона-Крика с целевым аналитом ДНК или РНК¹. Затем комплекс дифференцируется от аналита и несвязанного зонда с помощью различных методов. Некоторые методы, такие как Норн-блоттинг, гибридизация in situ или кПЦР, основаны на явлении комплементарного связывания². Наиболее распространенные гибридизаци....

Protocol

1. Проектирование DNM

1. Выберите уникальный участок в интересующем вас участке генома.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе используется участок генома вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в позициях 13972-14154 (OR652423.1).
2. Создайте набор праймеров для амплификации выделенного.......

Discussion

Проектирование ДНК-машин является простым, но требует некоторого опыта в разработке гибридизационных зондов или функциональных наноструктур ДНК. Целесообразно делать фрагмент анализируемого материала как можно короче, чтобы уменьшить количество возможных вторичн.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL tube	Biofil	CFT011015
100 bp+ DNA Ladder	Evrogen	NL002
100-1000 µL pipette	Kirgen	KG-Pro1000
10-100 µL pipette	Kirgen	KG-Pro100
1-10 µL pipette	Kirgen	KG-Pro10
20-200 µL pipette	Kirgen	KG-Pro200
2-20 µL pipette	Kirgen	KG-Pro20
4x Gel Loading Dye	Evrogen	PB020
Acrylamide 4K	AppliChem	A1090,0500
Ammonium persulfate	Carl Roth	2809447
Biorender	Biorender		https://www.biorender.com
Bisacrylamide	Molekula	22797959
Boric Acid	TechSnab	H-0202
ChemiDoc imaging system	BioRad	12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate	Corning	COS3915
DinaMelt	RNA Institute		http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTA	Amresco	Am-O105
Ethidium bromide	BioLabMix	EtBr-10
HEPES	Amresco	Am-O485
Magnesium chloride	AppliChem	131396
Mini Protean Tetra Cell	BioRad	1658001EDU
pipette 10 µL tips	Kirgen	KG1111-L
pipette 1000 µL tips	Kirgen	KG1636
pipette 200 µL tips	Kirgen	KG1212-L
Pixelmator Pro	Pixelmator Team		https://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chloride	Carl Roth	1782751
PowerPac Basic Power Supply	BioRad	1645050
RNAse/DNAse free water	Invitrogen	10977049
Sealing film for PCR plates	Sovtech	P-502
Sodium chloride	Vekton	HCh (0,1)
Spark multimode microplate reader	Tecan	Spark- 10M
T100 amplificator	BioRad	10014822
TEMED	Molekula	68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Amresco	Am-O497
UNAFold	RNA Institute		http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bath	LOIP	LB-140
Oligos used
Analyte:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:	Evrogen		direct order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT	Evrogen		direct order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA	Evrogen		direct order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1	DNA-Syntez		direct order, HPLC purification