Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Наномашины на основе ДНКферментов могут быть использованы для высокоселективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В данной статье описан подробный протокол проектирования наномашин на основе ДНКферментов с ядром 10-23 с использованием свободного программного обеспечения и их применение при обнаружении фрагмента вируса Эпштейна-Барр в качестве примера.

Abstract

Наномашины на основе ДНК (DNM) для обнаружения последовательностей ДНК и РНК (аналитов) представляют собой многофункциональные структуры, изготовленные из олигонуклеотидов. Их функции включают плотное связывание аналита, высокоселективное распознавание аналита, усиление флуоресцентного сигнала путем многократного каталитического расщепления флуорогенной репортерной подложки и притяжение флуорогенной подложки для увеличения отклика сенсора. Функциональные единицы прикрепляются к общему каркасу ДНК для их совместного действия. ДНК, расщепляющие РНК 10-23, отличаются повышенной чувствительностью по сравнению с некаталитическими гибридизационными зондами. Стабильность DNM и повышенные шансы распознавания субстрата обеспечиваются двухцепочечным фрагментом ДНК – плиткой. DNM может дифференцировать два аналита с разницей в одном нуклеотиде в свернутой РНК и двухцепочечной ДНК и обнаруживать аналиты в концентрациях в ~1000 раз ниже, чем у других зондов безбелковой гибридизации. В данной статье представлена концепция, лежащая в основе диагностического потенциала активности ДНК-наномашин, а также рассмотрены разработка, сборка и применение ДНК в анализах детекции нуклеиновых кислот.

Introduction

Одним из самых ранних методов обнаружения нуклеиновых кислот является комплементарное связывание селективных олигонуклеотидов с анализируемыми последовательностями РНК или ДНК. В этом методе используются фрагменты нуклеиновых кислот (зонды), которые могут образовывать пары оснований Уотсона-Крика с целевым аналитом ДНК или РНК1. Затем комплекс дифференцируется от аналита и несвязанного зонда с помощью различных методов. Некоторые методы, такие как Норн-блоттинг, гибридизация in situ или кПЦР, основаны на явлении комплементарного связывания2. Наиболее распространенные гибридизаци....

Protocol

1. Проектирование DNM

  1. Выберите уникальный участок в интересующем вас участке генома.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе используется участок генома вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в позициях 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Создайте набор праймеров для амплификации выделенного.......

Representative Results

Цель первого эксперимента состояла в том, чтобы показать сборку ДНМ до синтетического фрагмента анализируемого вещества. Все составляющие нити DNM добавляли в реакционный буфер и собирали в стакан. Собранный комплекс DNM оценивался на корректность по размеру и однород?.......

Discussion

Проектирование ДНК-машин является простым, но требует некоторого опыта в разработке гибридизационных зондов или функциональных наноструктур ДНК. Целесообразно делать фрагмент анализируемого материала как можно короче, чтобы уменьшить количество возможных вторичн.......

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

Авторы выражают благодарность Екатерине Владимировне Никитиной за любезное предоставление гДНК ВЭБ. Муханнад Атейя, Мария Юрьевна Березовская и Мария Сергеевна Рубель благодарят Министерство образования и науки Российской Федерации (грант No ФСЭР-2022-0009) и программу «Приоритет 2030».

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeBiofilCFT011015
100 bp+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 µL pipetteKirgenKG-Pro1000
10-100 µL pipetteKirgenKG-Pro100
1-10 µL pipetteKirgenKG-Pro10
20-200 µL pipetteKirgenKG-Pro200
2-20 µL pipetteKirgenKG-Pro20
4x Gel Loading DyeEvrogenPB020
Acrylamide 4KAppliChemA1090,0500
Ammonium persulfateCarl Roth2809447
BiorenderBiorenderhttps://www.biorender.com
BisacrylamideMolekula22797959
Boric AcidTechSnabH-0202
ChemiDoc imaging systemBioRad12003153
Costar 96-Well Black Polystyrene PlateCorningCOS3915
DinaMeltRNA Institutehttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Ethidium bromideBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Magnesium chlorideAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
pipette 10 µL tipsKirgenKG1111-L
pipette 1000 µL tipsKirgenKG1636
pipette 200 µL tipsKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Potassium chlorideCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050
RNAse/DNAse free waterInvitrogen10977049
Sealing film for PCR platesSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Spark multimode microplate readerTecanSpark- 10M
T100 amplificatorBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneAmrescoAm-O497
UNAFoldRNA Institutehttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Water bathLOIPLB-140
Oligos used
Analyte:Evrogendirect order, standard desalting purification
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG
ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG
GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogendirect order, standard desalting purification
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT
Evrogendirect order, standard desalting purification
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA
Evrogendirect order, standard desalting purification
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1
DNA-Syntezdirect order, HPLC purification

References

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

10 23

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved