A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Наномашины на основе ДНКферментов могут быть использованы для высокоселективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В данной статье описан подробный протокол проектирования наномашин на основе ДНКферментов с ядром 10-23 с использованием свободного программного обеспечения и их применение при обнаружении фрагмента вируса Эпштейна-Барр в качестве примера.
Наномашины на основе ДНК (DNM) для обнаружения последовательностей ДНК и РНК (аналитов) представляют собой многофункциональные структуры, изготовленные из олигонуклеотидов. Их функции включают плотное связывание аналита, высокоселективное распознавание аналита, усиление флуоресцентного сигнала путем многократного каталитического расщепления флуорогенной репортерной подложки и притяжение флуорогенной подложки для увеличения отклика сенсора. Функциональные единицы прикрепляются к общему каркасу ДНК для их совместного действия. ДНК, расщепляющие РНК 10-23, отличаются повышенной чувствительностью по сравнению с некаталитическими гибридизационными зондами. Стабильность DNM и повышенные шансы распознавания субстрата обеспечиваются двухцепочечным фрагментом ДНК – плиткой. DNM может дифференцировать два аналита с разницей в одном нуклеотиде в свернутой РНК и двухцепочечной ДНК и обнаруживать аналиты в концентрациях в ~1000 раз ниже, чем у других зондов безбелковой гибридизации. В данной статье представлена концепция, лежащая в основе диагностического потенциала активности ДНК-наномашин, а также рассмотрены разработка, сборка и применение ДНК в анализах детекции нуклеиновых кислот.
Одним из самых ранних методов обнаружения нуклеиновых кислот является комплементарное связывание селективных олигонуклеотидов с анализируемыми последовательностями РНК или ДНК. В этом методе используются фрагменты нуклеиновых кислот (зонды), которые могут образовывать пары оснований Уотсона-Крика с целевым аналитом ДНК или РНК1. Затем комплекс дифференцируется от аналита и несвязанного зонда с помощью различных методов. Некоторые методы, такие как Норн-блоттинг, гибридизация in situ или кПЦР, основаны на явлении комплементарного связывания2. Наиболее распространенные гибридизаци....
1. Проектирование DNM
Цель первого эксперимента состояла в том, чтобы показать сборку ДНМ до синтетического фрагмента анализируемого вещества. Все составляющие нити DNM добавляли в реакционный буфер и собирали в стакан. Собранный комплекс DNM оценивался на корректность по размеру и однород?.......
Проектирование ДНК-машин является простым, но требует некоторого опыта в разработке гибридизационных зондов или функциональных наноструктур ДНК. Целесообразно делать фрагмент анализируемого материала как можно короче, чтобы уменьшить количество возможных вторичн.......
Авторы выражают благодарность Екатерине Владимировне Никитиной за любезное предоставление гДНК ВЭБ. Муханнад Атейя, Мария Юрьевна Березовская и Мария Сергеевна Рубель благодарят Министерство образования и науки Российской Федерации (грант No ФСЭР-2022-0009) и программу «Приоритет 2030».
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL tube | Biofil | CFT011015 | |
100 bp+ DNA Ladder | Evrogen | NL002 | |
100-1000 µL pipette | Kirgen | KG-Pro1000 | |
10-100 µL pipette | Kirgen | KG-Pro100 | |
1-10 µL pipette | Kirgen | KG-Pro10 | |
20-200 µL pipette | Kirgen | KG-Pro200 | |
2-20 µL pipette | Kirgen | KG-Pro20 | |
4x Gel Loading Dye | Evrogen | PB020 | |
Acrylamide 4K | AppliChem | A1090,0500 | |
Ammonium persulfate | Carl Roth | 2809447 | |
Biorender | Biorender | https://www.biorender.com | |
Bisacrylamide | Molekula | 22797959 | |
Boric Acid | TechSnab | H-0202 | |
ChemiDoc imaging system | BioRad | 12003153 | |
Costar 96-Well Black Polystyrene Plate | Corning | COS3915 | |
DinaMelt | RNA Institute | http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php | |
EDTA | Amresco | Am-O105 | |
Ethidium bromide | BioLabMix | EtBr-10 | |
HEPES | Amresco | Am-O485 | |
Magnesium chloride | AppliChem | 131396 | |
Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658001EDU | |
pipette 10 µL tips | Kirgen | KG1111-L | |
pipette 1000 µL tips | Kirgen | KG1636 | |
pipette 200 µL tips | Kirgen | KG1212-L | |
Pixelmator Pro | Pixelmator Team | https://www.pixelmator.com/pro/ | |
Potassium chloride | Carl Roth | 1782751 | |
PowerPac Basic Power Supply | BioRad | 1645050 | |
RNAse/DNAse free water | Invitrogen | 10977049 | |
Sealing film for PCR plates | Sovtech | P-502 | |
Sodium chloride | Vekton | HCh (0,1) | |
Spark multimode microplate reader | Tecan | Spark- 10M | |
T100 amplificator | BioRad | 10014822 | |
TEMED | Molekula | 68604730 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Amresco | Am-O497 | |
UNAFold | RNA Institute | http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php | |
Water bath | LOIP | LB-140 | |
Oligos used | |||
Analyte: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
GAGCACTTGGTCAGGCACACGG ACAGGGTCAGCGGAGGACGCG TGGCACAGCAGCCCGGGGTAG GTCCCCTGGACCTGCCGCTGG CGGACTACGCCTTCGTTGC | |||
Tile-Arm3: | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT TTGCTGACTACTGTCACCTCT CTGCTAGTCT | |||
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC CGCTGACCACAACGAGAGGAA ACCTT | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT GTCCGTGTGCCTGACCA | Evrogen | direct order, standard desalting purification | |
F-sub oligonucleotide: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU CCCTGGGCA-BHQ1 | DNA-Syntez | direct order, HPLC purification |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved