Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

Summary

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Abstract

חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא חלבון שמור המאפשר קיפול של חלבונים אחרים בתוך התא, מה שהופך אותו למלווה מולקולרי. בעוד Hsp70 אינו חיוני עבור תאי E. coli הגדלים בתנאים רגילים, מלווה זה הופך להיות חיוני לצמיחה בטמפרטורות גבוהות. מאחר ש-Hsp70 שמור מאוד, אחת הדרכים לחקור את תפקוד המלווה של גנים מסוג Hsp70 ממינים שונים היא לבטא אותם באופן הטרולוגי בזני E. coli שחסרים ב-Hsp70 או לבטא Hsp70 מקורי שנפגע מבחינה תפקודית. תאי E. coli dnaK756 אינם מסוגלים לתמוך בדנ"א של λ בקטריופאג'. יתר על כן, Hsp70 (DnaK) המקומי שלהם מציג פעילות ATPase מוגברת תוך הפגנת זיקה מופחתת ל- GrpE (גורם חילופי נוקלאוטידים Hsp70). כתוצאה מכך, תאי E. coli dnaK756 גדלים כראוי בטמפרטורות הנעות בין 30 °C (75 °F) ל 37 °C (75 °F), אך הם מתים בטמפרטורות גבוהות (>40 °C). מסיבה זו, תאים אלה משמשים מודל לחקר פעילות המלווה של Hsp70. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליישום תאים אלה לביצוע בדיקת השלמה, המאפשרת לחקור את פונקציית מלווה הצלולו של Hsp70.

Introduction

חלבוני הלם חום ממלאים תפקיד חשוב כמלווים מולקולריים בכך שהם מסייעים לקיפול חלבונים, מונעים צבירת חלבונים והופכים קיפול שגוי^של חלבונים ^1,2. חלבון הלם חום 70 (Hsp70) הוא אחד המלווים המולקולריים הבולטים ביותר, הממלא תפקיד מרכזי בהומאוסטזיס של חלבון ^3,4. DnaK הוא E. coli Hsp70 homologue⁵.

בדיקות ביופיזיקליות, ביוכימיות ומבוססות תאים שונות פותחו כדי לחקור את פעילות המלווה של Hsp70 ולסנן מעכבים המכוונים למלווה זה ^6,7,8

Protocol

1. טרנספורמציה

הערה: השתמש בכלי זכוכית סטריליים לתרבית, קצוות פיפטה ומדיה טרייה ואוטומטית. הכינו תרביות של תאי E. coli ב-2x שמרים טריפטון (YT) [1.6% טריפטון (w/v), 1% תמצית שמרים (w/v), 0.5% NaCl (w/v), 1.5% אגר (w/v)] אגר. ריאגנטים כלליים המשמשים בפרוטוקול ומקורותיהם מובאים בטבלת החומ.......

Discussion

הפרוטוקול מדגים את התועלת של תאי E. coli dnaK756בחקר תפקוד המלווה של Hsp70 מבוטא באופן הטרולוגי. בדיקה זו יכולה להיות מאומצת כדי לסנן מעכבים המכוונים לתפקוד Hsp70 בצלולו. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי Hsp70s שאינם מסוגלים להחליף DnaK ב E. coli אינם תואמים לבדיקה זו. חוסר שינוי לאחר תרגום

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody