Анализ комплементации на основе Escherichia coli для изучения шаперонной функции белка теплового шока 70

Summary

Этот протокол демонстрирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70). Клетки E. coli dnaK756 служат моделью для анализа, поскольку они содержат нативный, функционально ослабленный Hsp70, что делает их восприимчивыми к тепловому стрессу. Гетерологичное введение функционального Hsp70 спасает дефицит роста клеток.

Abstract

Белок теплового шока 70 (Hsp70) является консервативным белком, который способствует сворачиванию других белков в клетке, что делает его молекулярным шапероном. В то время как Hsp70 не является необходимым для клеток E. coli , растущих в нормальных условиях, этот шаперон становится незаменимым для роста при повышенных температурах. Поскольку Hsp70 обладает высокой консервативностью, одним из способов изучения шаперонной функции генов Hsp70 различных видов является их гетерологическая экспрессия в штаммах E. coli , которые либо испытывают дефицит Hsp70, либо экспрессируют нативный Hsp70, который функционально скомпрометирован. Клетки E. coli dnaK756 не способны поддерживать λ ДНК бактериофага. Кроме того, их нативный Hsp70 (DnaK) проявляет повышенную активность АТФазы, демонстрируя при этом пониженное сродство к GrpE (фактор нуклеотидного обмена Hsp70). В результате клетки E. coli dnaK756 адекватно растут при температуре от 30 °C до 37 °C, но погибают при повышенных температурах (>40 °C). По этой причине эти клетки служат моделью для изучения шаперонной активности Hsp70. Здесь мы опишем подробный протокол применения этих клеток для проведения анализа комплементации, позволяющего изучить функцию шаперона в целлюлоне Hsp70.

Introduction

Белки теплового шока играют важную роль в качестве молекулярных шаперонов, облегчая сворачивание белков, предотвращая агрегацию белков и обращая вспять неправильное сворачивание белков ^1,2. Белок теплового шока 70 (Hsp70) является одним из наиболее известных молекулярных шаперонов, играющих центральную роль в белковом гомеостазе ^3,4. DnaK является гомологом E. coli Hsp70⁵.

Различные биофизические, биохимические и клеточные анализы были разработаны для изучения активности шаперона Hsp70 и скри....

Protocol

1. Трансформация

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную стеклянную посуду для закваскивания, наконечники пипеток и свежеприготовленные и автоклавные среды. Приготавливают культуры клеток E. coli в 2х дрожжевых триптоне (YT) [1,6% триптон (w/v), 1% экстракт дрожжей (w/v), 0,5% N.......

Discussion

Протокол демонстрирует полезность клеток E. coli dnaK756в исследовании шаперонной функции гетерологически экспрессируемого Hsp70. Этот анализ может быть использован для скрининга ингибиторов, нацеленных на функцию Hsp70 в целлюло. Однако одним из ограничений этого метода является то, .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	8,05,740	Constituent for sample loading dye
Acetic acid	Labchem	101005125	Constituent of destainer
Acrylamide	Sigma-Aldrich	8008300100	Component of SDS
Agar	Merck	HG000BX1.500	Constituent of medium and liquid growth assay
Agarose	Clever Scientific	14131031	Certified molecular biology agarose
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	101875295	Constituent for SDS-PAGE gel
Ampicillin	VWR International	0339—EU—25G	Selective antibiotic
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Component of SDS
Bromophenol	Sigma-Aldrich	0449-25G	Constituent for sample loading dye
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	For competent cells preparation
Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE dye
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	RB10368	Constituent of PBS buffer
ECL	Thermofischer Scientific	32109	Western blot detection reagent
Ethidium Bromide	Thermofischer Scientific	17898	DNA intercalating dye
Glycerol	Merck	SAAR2676520L	Constituent for sample loading dye
Glycine	VWR International	10119CU	Component of SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	inducer
Kanamycin	Melford	K0126	Selective antibiotic
Magnesium Chloride	Merck	SAAR4123000EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Methanol	Labchem	113140129	Constituent of destainer
Monobasic potassium phosphate	Merck	1,04,87,30,250	Constituent of PBS buffer
Peptone	Merck	HG000BX4.250	Constituent of medium and liquid growth assay
Potassium chloride	Merck	SAAR5042020EM	Constituent of PBS buffer
PVDF membrane	Thermofischer scientific	PB7320	Western blot membrane
Sodium Chloride	Merck	SAAR5822320EM	Constituent of medium and liquid growth assay
Sodium dodecyl sulphate	VWR International	108073	To resolve expressed proteins
Spectramax iD3	Separations	373705019	Automated plate reader
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Component of SDS gel
Tetracycline	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Selective antibiotic
Tris	VWR International	19A094101	Component of SDS gel
Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Constituent for Western wash buffer
Western transfer chamber	Thermofisher Scientific	PB0112	Transfer of protein to nitrocellulose membrane
Yeast extract	Merck	HG000BX6.500	Constituent of medium and liquid growth assay
α-DnaK antibody	Inqaba	BK CAC09317	Primary antibody
α-rabbit antibody	Thermofischer scientific	31460	Secondary antibody