Rastreamento da fibrinólise de coágulos sanguíneos totais formados por alça de Chandler sob fluxo de cisalhamento em um modelo de trombólise in vitro

Summary

Os ensaios de trombólise in vitro muitas vezes têm lutado para replicar as condições in vivo, seja no trombo modelo que está sendo digerido ou no ambiente em que a trombólise está ocorrendo. Aqui, exploramos como o acoplamento do loop de Chandler e do ensaio de fibrinólise de fluxo fluorométrico em tempo real (RT-FluFF) é usado para monitoramento de lise de coágulo de alta fidelidade, ex-vivo.

Abstract

O tromboembolismo e as complicações relacionadas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo e vários ensaios foram desenvolvidos para testar a eficiência dos medicamentos trombolíticos in vitro e in vivo. Há uma demanda crescente por modelos de coágulos in vitro fisiologicamente mais relevantes para o desenvolvimento de medicamentos devido à complexidade e ao custo associados aos modelos animais, além de sua frequentemente falta de traduzibilidade para a fisiologia humana. Fluxo, pressão e taxa de cisalhamento são características importantes do sistema circulatório, com coágulos formados sob fluxo exibindo morfologia e características de digestão diferentes dos coágulos formados estaticamente. Esses fatores geralmente não são representados em ensaios convencionais de digestão de coágulos in vitro , o que pode ter implicações farmacológicas que afetam as taxas de sucesso da tradução de medicamentos.

O ensaio defluorólise orométrica de Flowing (RT-FluFF) foi desenvolvido como uma plataforma de teste de trombólise de alta fidelidade que usa coágulos marcados com fluorescência formados sob fluxo de cisalhamento, que são então digeridos usando plasma circulante na presença ou ausência de agentes farmacêuticos fibrinolíticos. Modificar as taxas de fluxo das etapas de formação e digestão do coágulo permite que o sistema imite as condições arteriais, pulmonares e venosas em configurações experimentais altamente diversas. As medições podem ser feitas continuamente usando um fluorômetro em linha ou tomando pontos de tempo discretos, bem como uma medição convencional da massa do coágulo do ponto final. O ensaio RT-FluFF é um sistema flexível que permite o rastreamento em tempo real da digestão do coágulo sob condições de fluxo que representam com mais precisão as condições fisiológicas in vivo, mantendo o controle e a reprodutibilidade de um sistema de teste in vitro.

Introduction

As doenças decorrentes fundamentalmente de etiologias tromboembólicas apresentam uma importante fonte de morbidade e mortalidade na sociedade atual. As manifestações da patogênese tromboembólica incluem, mas não estão limitadas a, infartos do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, tromboses venosas profundas e embolia pulmonar¹. Uma enorme quantidade de pesquisas em andamento, abrangendo várias disciplinas, gira em torno do desenvolvimento de métodos seguros e eficazes para lidar com a trombose patogênica. Variações nas manifestações arteriais e venosas da trombose e localizações anatômicas variadas resultaram no desenvolvimento ....

Protocol

Todos os métodos mencionados abaixo estão de acordo com os protocolos do conselho de revisão institucional (IRB) e do comitê institucional de ética em pesquisa humana. Todos os voluntários saudáveis forneceram consentimento informado e por escrito antes da doação de sangue. É importante observar que todos os materiais referenciados no protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Embora o WB e o plasma humanos sejam discutidos ao longo deste protocolo, o uso de sangue animal de pesqui.......

Discussion

Formação e rotulagem de coágulos
A alça de Chandler demonstrou fornecer um meio fácil e eficaz de gerar coágulos de forma reprodutível que imitam trombos in vivo ¹⁶. Parâmetros de ajuste fino, como tamanho da tubulação, velocidades de rotação, diâmetro do tambor e tempo de coagulação, permitem a rápida geração de coágulos sob diferentes condições de cisalhamento que podem capturar características arquitetônicas apreciadas em uma variedade de trom.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,