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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Os ensaios de trombólise in vitro muitas vezes têm lutado para replicar as condições in vivo, seja no trombo modelo que está sendo digerido ou no ambiente em que a trombólise está ocorrendo. Aqui, exploramos como o acoplamento do loop de Chandler e do ensaio de fibrinólise de fluxo fluorométrico em tempo real (RT-FluFF) é usado para monitoramento de lise de coágulo de alta fidelidade, ex-vivo.

Abstract

O tromboembolismo e as complicações relacionadas são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo e vários ensaios foram desenvolvidos para testar a eficiência dos medicamentos trombolíticos in vitro e in vivo. Há uma demanda crescente por modelos de coágulos in vitro fisiologicamente mais relevantes para o desenvolvimento de medicamentos devido à complexidade e ao custo associados aos modelos animais, além de sua frequentemente falta de traduzibilidade para a fisiologia humana. Fluxo, pressão e taxa de cisalhamento são características importantes do sistema circulatório, com coágulos formados sob fluxo exibindo morfologia e características de digestão diferentes dos coágulos formados estaticamente. Esses fatores geralmente não são representados em ensaios convencionais de digestão de coágulos in vitro , o que pode ter implicações farmacológicas que afetam as taxas de sucesso da tradução de medicamentos.

O ensaio defluorólise orométrica de Flowing (RT-FluFF) foi desenvolvido como uma plataforma de teste de trombólise de alta fidelidade que usa coágulos marcados com fluorescência formados sob fluxo de cisalhamento, que são então digeridos usando plasma circulante na presença ou ausência de agentes farmacêuticos fibrinolíticos. Modificar as taxas de fluxo das etapas de formação e digestão do coágulo permite que o sistema imite as condições arteriais, pulmonares e venosas em configurações experimentais altamente diversas. As medições podem ser feitas continuamente usando um fluorômetro em linha ou tomando pontos de tempo discretos, bem como uma medição convencional da massa do coágulo do ponto final. O ensaio RT-FluFF é um sistema flexível que permite o rastreamento em tempo real da digestão do coágulo sob condições de fluxo que representam com mais precisão as condições fisiológicas in vivo, mantendo o controle e a reprodutibilidade de um sistema de teste in vitro.

Introduction

As doenças decorrentes fundamentalmente de etiologias tromboembólicas apresentam uma importante fonte de morbidade e mortalidade na sociedade atual. As manifestações da patogênese tromboembólica incluem, mas não estão limitadas a, infartos do miocárdio, acidentes vasculares cerebrais isquêmicos, tromboses venosas profundas e embolia pulmonar1. Uma enorme quantidade de pesquisas em andamento, abrangendo várias disciplinas, gira em torno do desenvolvimento de métodos seguros e eficazes para lidar com a trombose patogênica. Variações nas manifestações arteriais e venosas da trombose e localizações anatômicas variadas resultaram no desenvolvimento ....

Protocol

Todos os métodos mencionados abaixo estão de acordo com os protocolos do conselho de revisão institucional (IRB) e do comitê institucional de ética em pesquisa humana. Todos os voluntários saudáveis forneceram consentimento informado e por escrito antes da doação de sangue. É importante observar que todos os materiais referenciados no protocolo podem ser encontrados na Tabela de Materiais. Embora o WB e o plasma humanos sejam discutidos ao longo deste protocolo, o uso de sangue animal de pesqui.......

Representative Results

Formação de coágulo de alça de Chandler
Na formação de coágulos, geralmente buscamos quadruplicados para garantir que, se existissem outliers de coágulos (com base na morfologia bruta e na massa), ainda tivéssemos a capacidade de executar ensaios de trombólise triplicada. Assumindo condições ideais de carga, os coágulos devem ser todos bastante uniformes em comprimento (~ 3,3 cm), peso (~ 100 mg) e aparência, conforme representado na Figura 3. Ao empregar o .......

Discussion

Formação e rotulagem de coágulos
A alça de Chandler demonstrou fornecer um meio fácil e eficaz de gerar coágulos de forma reprodutível que imitam trombos in vivo 16. Parâmetros de ajuste fino, como tamanho da tubulação, velocidades de rotação, diâmetro do tambor e tempo de coagulação, permitem a rápida geração de coágulos sob diferentes condições de cisalhamento que podem capturar características arquitetônicas apreciadas em uma variedade de trom.......

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R01HL167877. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G Disposable Hypodermic NeedlesExel International 26439Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm LonguxcellB07SXGSQ82Chandler loop, 
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent MicroplateCorning3635Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL SyringesAir-TiteMLB3RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water SystemSartoriusNADI water source
Calcium ChlorideMillipore SigmaC5670Other Consumables
Disposable BP TransducersAD InstrumentsMLT0670RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed PodDrager5588822RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient MonitorDragerSC 7000RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)Chandler loop,
Face ShieldMoxeSHIELDS10Chandler loop, 
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo ScientificF13191Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-SterileMasterflex30600-04RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)Thermo Scientific119245000Other Consumables
General-Purpose Water BathThermo Scientific2839Chandler loop, 
Hotplate 4 × 4Fisher Scientific1152016HRT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-FrozenZen-BioSER-SPLOther Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood Zen-BioSER-WB-SDS Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS RotorMasterflex77200-62RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VACMasterflex7528-10RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed ControllerCoCocinaZK-MGChandler loop, 
Nalgene Tubing T-Type ConnectorsThermo Scientific6151-0312RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing Masterflex06424-15 Other Consumables
Phosphate buffered salineMillipore SigmaP3813Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)Molecular DevicesM5RT-FluFF Apparatus
Switching Power SupplySoulBayUC03UChandler loop, 
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mLThermo ScientificS751010Other Consumables
Tissue plasminogen activator, humanMillipore SigmaT0831Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''Fisher ScientificAGL00017Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"TygonND-100-65, ADF 00009 Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV FlashlightuvBeastuvB-V3-365-MINIChandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpmPangyooZGA37RGChandler loop, 

References

  1. Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
  2. Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a re....

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Keywords TromboembolismoDroga Trombol ticaModelo de Co gulo In vitroFluxo de CisalhamentoMorfologia do Co guloDigest o do Co guloFibrin liseEnsaio RT FluFFRastreamento Fluorom tricoFisiologicamente RelevanteDesenvolvimento de Medicamentos

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