Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.

Abstract

Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.

Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.

Introduction

Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию1. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое ле....

Protocol

Все методы, упомянутые ниже, соответствуют протоколам институционального наблюдательного совета (IRB) и институционального комитета по этике исследований человека. Все здоровые добровольцы предоставили письменное и информированное согласие до сдачи крови. Следует отметить, что все ма.......

Representative Results

Образование тромба петли Чандлера
При формировании тромбов мы, как правило, стремились к квадрупликатам, чтобы гарантировать, что при наличии каких-либо выбросов сгустков (на основе общей морфологии и массы) у нас все еще есть возможность проводить тройной анализ тромболизи?.......

Discussion

Образование сгустков и маркировка
Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени.......

Acknowledgements

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No R01HL167877. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G Disposable Hypodermic NeedlesExel International 26439Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm LonguxcellB07SXGSQ82Chandler loop, 
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent MicroplateCorning3635Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL SyringesAir-TiteMLB3RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water SystemSartoriusNADI water source
Calcium ChlorideMillipore SigmaC5670Other Consumables
Disposable BP TransducersAD InstrumentsMLT0670RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed PodDrager5588822RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient MonitorDragerSC 7000RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)Chandler loop,
Face ShieldMoxeSHIELDS10Chandler loop, 
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo ScientificF13191Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-SterileMasterflex30600-04RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)Thermo Scientific119245000Other Consumables
General-Purpose Water BathThermo Scientific2839Chandler loop, 
Hotplate 4 × 4Fisher Scientific1152016HRT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-FrozenZen-BioSER-SPLOther Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood Zen-BioSER-WB-SDS Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS RotorMasterflex77200-62RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VACMasterflex7528-10RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed ControllerCoCocinaZK-MGChandler loop, 
Nalgene Tubing T-Type ConnectorsThermo Scientific6151-0312RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing Masterflex06424-15 Other Consumables
Phosphate buffered salineMillipore SigmaP3813Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)Molecular DevicesM5RT-FluFF Apparatus
Switching Power SupplySoulBayUC03UChandler loop, 
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mLThermo ScientificS751010Other Consumables
Tissue plasminogen activator, humanMillipore SigmaT0831Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''Fisher ScientificAGL00017Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"TygonND-100-65, ADF 00009 Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV FlashlightuvBeastuvB-V3-365-MINIChandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpmPangyooZGA37RGChandler loop, 

References

  1. Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
  2. Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a re....

Explore More Articles

in vitroRT fluFF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved