Отслеживание фибринолиза цельных кровяных сгустков, образованных петлей Чандлера, под действием сдвигового потока в модели тромболизиса in vitro

Summary

Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.

Abstract

Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.

Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.

Introduction

Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию¹. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое ле....

Protocol

Все методы, упомянутые ниже, соответствуют протоколам институционального наблюдательного совета (IRB) и институционального комитета по этике исследований человека. Все здоровые добровольцы предоставили письменное и информированное согласие до сдачи крови. Следует отметить, что все ма.......

Discussion

Образование сгустков и маркировка
Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 G Disposable Hypodermic Needles	Exel International	26439	Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long	uxcell	B07SXGSQ82	Chandler loop,
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate	Corning	3635	Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water System	Sartorius	NA	DI water source
Calcium Chloride	Millipore Sigma	C5670	Other Consumables
Disposable BP Transducers	AD Instruments	MLT0670	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed Pod	Drager	5588822	RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient Monitor	Drager	SC 7000	RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)			Chandler loop,
Face Shield	Moxe	SHIELDS10	Chandler loop,
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Thermo Scientific	F13191	Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile	Masterflex	30600-04	RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Other Consumables
General-Purpose Water Bath	Thermo Scientific	2839	Chandler loop,
Hotplate 4 × 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-Frozen	Zen-Bio	SER-SPL	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood	Zen-Bio	SER-WB-SDS	Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed Controller	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing	Masterflex	06424-15	Other Consumables
Phosphate buffered saline	Millipore Sigma	P3813	Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)	Molecular Devices	M5	RT-FluFF Apparatus
Switching Power Supply	SoulBay	UC03U	Chandler loop,
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Other Consumables
Tissue plasminogen activator, human	Millipore Sigma	T0831	Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''	Fisher Scientific	AGL00017	Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009	Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Chandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm	Pangyoo	ZGA37RG	Chandler loop,