Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.

Abstract

Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.

Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.

Introduction

Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию1. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое ле....

Protocol

Все методы, упомянутые ниже, соответствуют протоколам институционального наблюдательного совета (IRB) и институционального комитета по этике исследований человека. Все здоровые добровольцы предоставили письменное и информированное согласие до сдачи крови. Следует отметить, что все ма.......

Representative Results

Образование тромба петли Чандлера
При формировании тромбов мы, как правило, стремились к квадрупликатам, чтобы гарантировать, что при наличии каких-либо выбросов сгустков (на основе общей морфологии и массы) у нас все еще есть возможность проводить тройной анализ тромболизи?.......

Discussion

Образование сгустков и маркировка
Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени.......

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No R01HL167877. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30 G Disposable Hypodermic NeedlesExel International 26439Other Consumables
6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm LonguxcellB07SXGSQ82Chandler loop, 
96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent MicroplateCorning3635Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile
Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL SyringesAir-TiteMLB3RT-FluFF Apparatus , dampeners
Arium Mini Plus Ultrapure Water SystemSartoriusNADI water source
Calcium ChlorideMillipore SigmaC5670Other Consumables
Disposable BP TransducersAD InstrumentsMLT0670RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans HemoMed PodDrager5588822RT-FluFF Apparatus
Drager Siemans Patient MonitorDragerSC 7000RT-FluFF Apparatus
Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)Chandler loop,
Face ShieldMoxeSHIELDS10Chandler loop, 
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 ConjugateThermo ScientificF13191Other Consumables
Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-SterileMasterflex30600-04RT-FluFF Apparatus
Fluorescein (FITC)Thermo Scientific119245000Other Consumables
General-Purpose Water BathThermo Scientific2839Chandler loop, 
Hotplate 4 × 4Fisher Scientific1152016HRT-FluFF Apparatus
Human Source Plasma Fresh-FrozenZen-BioSER-SPLOther Consumables, CPDA-1 anticoagulant
Human Whole Blood Zen-BioSER-WB-SDS Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant
L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS RotorMasterflex77200-62RT-FluFF Apparatus, Pump Head
L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VACMasterflex7528-10RT-FluFF Apparatus, Pump
Motor Speed ControllerCoCocinaZK-MGChandler loop, 
Nalgene Tubing T-Type ConnectorsThermo Scientific6151-0312RT-FluFF Apparatus
Peristaltic pump tubing Masterflex06424-15 Other Consumables
Phosphate buffered salineMillipore SigmaP3813Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)Molecular DevicesM5RT-FluFF Apparatus
Switching Power SupplySoulBayUC03UChandler loop, 
Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mLThermo ScientificS751010Other Consumables
Tissue plasminogen activator, humanMillipore SigmaT0831Other Consumables
Tubing ID 1/4'', OD 3/8''Fisher ScientificAGL00017Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors
Tubing ID 5/32", OD 7/32"TygonND-100-65, ADF 00009 Other Consumables
V3 365 nm Mini - Black Light UV FlashlightuvBeastuvB-V3-365-MINIChandler loop, used to check completed clots
ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpmPangyooZGA37RGChandler loop, 

References

  1. Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).
  2. Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a re....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

in vitroRT fluFF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved