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Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.
La caratterizzazione funzionale delle proteine richiede che esse siano espresse e purificate in quantità sostanziali con elevata purezza per eseguire saggi biochimici. Il sistema di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) consente la separazione ad alta risoluzione di miscele proteiche complesse. Regolando vari parametri in FPLC, come la selezione della matrice di purificazione appropriata, la regolazione della temperatura del campione proteico e la gestione della velocità di flusso del campione sulla matrice e della velocità di eluizione, è possibile garantire la stabilità e la funzionalità della proteina. In questo protocollo, dimostreremo la versatilità del sistema FPLC per purificare la proteina endonucleasi 1 (FEN1) del lembo marcata 6X-His, prodotta in colture batteriche. Per migliorare l'efficienza della purificazione delle proteine, ci concentreremo su molteplici considerazioni, tra cui il corretto imballaggio e preparazione della colonna, l'iniezione del campione utilizzando un circuito di campionamento, la velocità di flusso dell'applicazione del campione alla colonna e i parametri di eluizione del campione. Infine, il cromatogramma sarà analizzato per identificare le frazioni contenenti alte rese di proteine e considerazioni per una corretta conservazione a lungo termine delle proteine ricombinanti. L'ottimizzazione dei metodi di purificazione delle proteine è fondamentale per migliorare la precisione e l'affidabilità dell'analisi delle proteine.
Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l'impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca p....
1. Preparazione del campione
I lisati cellulari BL21 (DE3) che esprimono hFEN1 sono stati fatti passare attraverso resine Ni-NTA e TALON equilibrate. La resina Ni-NTA è caricata con ioni Ni2+ e ha un'elevata capacità legante. I risultati mostrano che la resina Ni-NTA produce una quantità maggiore di FEN1 rispetto alla resina TALON (Figura 7). La resina Ni-NTA è anche nota per legarsi in modo non specifico ad altre proteine espresse cromosomicamente. Il lisato cellulare pa.......
La cromatografia di affinità è una tecnica ampiamente utilizzata per purificare le proteine leganti il DNA. La cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) è un tipo specifico di cromatografia di affinità che utilizza ioni metallici per catturare i residui di istidina di una sequenza peptidica. Questo è il motivo per cui il "tag 6X-Hi" o "tag poly-Hi" è attaccato all'N-terminale o al C-terminale delle proteine da purificare. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metal.......
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della National Science Foundation (1929346) e dell'American Cancer Society (RSG-21-028-01). Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Balakrishnan per le utili discussioni.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
4x Laemmli sample buffer | BioRad | 1610747 | |
Acetic acid | Merck | UN2789 | |
Beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M-6250 | |
Chromlab software version 6.1.27.0 | BioRad | operates the NGC system | |
Complete MINI protease inhibitor tablet | Roche | 11836153001 | |
Coomassie Brilliant Blue R | Sigma | B0149 | |
Dithiothreitol (DTT) | Dot Scientific | DSD11000 | |
Econo-Column glass | BioRad | 7371512 | |
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) | Dot Scientific | DSE57020 | |
Flow adaptor | BioRad | 7380014 | |
Glycerol | Dot Scientific | DSG22020 | |
Imidazole | Dot Scientific | DSI52000 | |
Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
Mini PROTEAN TGX gels | BioRad | 4561084 | |
NGC Chromatography System | BioRad | automated liquid chromatography system | |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 1018244 | |
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride | Dot Scientific | DSP20270 | |
PreScission Plus Protein Dual Color Standards | BioRad | 1610374 | |
Sodium chloride | Dot Scientific | DSS23020 | |
TALON metal affinity resin | Takara | 635502 | |
Tris Base | DST60040 |
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