Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce

Summary

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Abstract

La caratterizzazione funzionale delle proteine richiede che esse siano espresse e purificate in quantità sostanziali con elevata purezza per eseguire saggi biochimici. Il sistema di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) consente la separazione ad alta risoluzione di miscele proteiche complesse. Regolando vari parametri in FPLC, come la selezione della matrice di purificazione appropriata, la regolazione della temperatura del campione proteico e la gestione della velocità di flusso del campione sulla matrice e della velocità di eluizione, è possibile garantire la stabilità e la funzionalità della proteina. In questo protocollo, dimostreremo la versatilità del sistema FPLC per purificare la proteina endonucleasi 1 (FEN1) del lembo marcata 6X-His, prodotta in colture batteriche. Per migliorare l'efficienza della purificazione delle proteine, ci concentreremo su molteplici considerazioni, tra cui il corretto imballaggio e preparazione della colonna, l'iniezione del campione utilizzando un circuito di campionamento, la velocità di flusso dell'applicazione del campione alla colonna e i parametri di eluizione del campione. Infine, il cromatogramma sarà analizzato per identificare le frazioni contenenti alte rese di proteine e considerazioni per una corretta conservazione a lungo termine delle proteine ricombinanti. L'ottimizzazione dei metodi di purificazione delle proteine è fondamentale per migliorare la precisione e l'affidabilità dell'analisi delle proteine.

Introduction

Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l'impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca p....

Protocol

1. Preparazione del campione

1. Per purificare il FEN1 ricombinante, esprimere il costrutto (pET-FCH-FEN1) nelle cellule BL21(DE3) come precedentemente descritto da Ononye et ^al.8.
   1. Inoculare il terreno LB (Tabella 1) con l'1% di coltura notturna e far crescere le cellule a 37 °C fino a quando l'OD raggiunge 0,6.
   2. Indurre con 0,4 M di isopropil-beta-D-tiogalattoside (IPTG) e far crescere la coltura per altr.......

Discussion

La cromatografia di affinità è una tecnica ampiamente utilizzata per purificare le proteine leganti il DNA. La cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) è un tipo specifico di cromatografia di affinità che utilizza ioni metallici per catturare i residui di istidina di una sequenza peptidica. Questo è il motivo per cui il "tag 6X-Hi" o "tag poly-Hi" è attaccato all'N-terminale o al C-terminale delle proteine da purificare. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metal.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040