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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Abstract

La caratterizzazione funzionale delle proteine richiede che esse siano espresse e purificate in quantità sostanziali con elevata purezza per eseguire saggi biochimici. Il sistema di cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC) consente la separazione ad alta risoluzione di miscele proteiche complesse. Regolando vari parametri in FPLC, come la selezione della matrice di purificazione appropriata, la regolazione della temperatura del campione proteico e la gestione della velocità di flusso del campione sulla matrice e della velocità di eluizione, è possibile garantire la stabilità e la funzionalità della proteina. In questo protocollo, dimostreremo la versatilità del sistema FPLC per purificare la proteina endonucleasi 1 (FEN1) del lembo marcata 6X-His, prodotta in colture batteriche. Per migliorare l'efficienza della purificazione delle proteine, ci concentreremo su molteplici considerazioni, tra cui il corretto imballaggio e preparazione della colonna, l'iniezione del campione utilizzando un circuito di campionamento, la velocità di flusso dell'applicazione del campione alla colonna e i parametri di eluizione del campione. Infine, il cromatogramma sarà analizzato per identificare le frazioni contenenti alte rese di proteine e considerazioni per una corretta conservazione a lungo termine delle proteine ricombinanti. L'ottimizzazione dei metodi di purificazione delle proteine è fondamentale per migliorare la precisione e l'affidabilità dell'analisi delle proteine.

Introduction

Sono disponibili numerose strategie per comprendere la biologia cellulare. Un approccio prevede una strategia top-down, in cui le mutazioni genetiche vengono introdotte in un gene, seguite dalla valutazione dei cambiamenti fenotipici risultanti in un organismo modello. Al contrario, un approccio riduzionista comporta la delucidazione iniziale dei meccanismi molecolari e delle funzioni enzimatiche di una particolare proteina, accompagnata dalla caratterizzazione delle sue interazioni con altri componenti cellulari. Successivamente, viene valutato l'impatto di questa proteina su un percorso biologico. Sebbene ogni approccio di ricerca p....

Protocol

1. Preparazione del campione

  1. Per purificare il FEN1 ricombinante, esprimere il costrutto (pET-FCH-FEN1) nelle cellule BL21(DE3) come precedentemente descritto da Ononye et al.8.
    1. Inoculare il terreno LB (Tabella 1) con l'1% di coltura notturna e far crescere le cellule a 37 °C fino a quando l'OD raggiunge 0,6.
    2. Indurre con 0,4 M di isopropil-beta-D-tiogalattoside (IPTG) e far crescere la coltura per altr.......

Representative Results

I lisati cellulari BL21 (DE3) che esprimono hFEN1 sono stati fatti passare attraverso resine Ni-NTA e TALON equilibrate. La resina Ni-NTA è caricata con ioni Ni2+ e ha un'elevata capacità legante. I risultati mostrano che la resina Ni-NTA produce una quantità maggiore di FEN1 rispetto alla resina TALON (Figura 7). La resina Ni-NTA è anche nota per legarsi in modo non specifico ad altre proteine espresse cromosomicamente. Il lisato cellulare pa.......

Discussion

La cromatografia di affinità è una tecnica ampiamente utilizzata per purificare le proteine leganti il DNA. La cromatografia di affinità con metalli immobilizzati (IMAC) è un tipo specifico di cromatografia di affinità che utilizza ioni metallici per catturare i residui di istidina di una sequenza peptidica. Questo è il motivo per cui il "tag 6X-Hi" o "tag poly-Hi" è attaccato all'N-terminale o al C-terminale delle proteine da purificare. Il nichel e il cobalto sono gli ioni metal.......

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni della National Science Foundation (1929346) e dell'American Cancer Society (RSG-21-028-01). Vorremmo anche ringraziare i membri del laboratorio Balakrishnan per le utili discussioni.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4x Laemmli sample bufferBioRad1610747
Acetic acidMerckUN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)SigmaM-6250
Chromlab software version 6.1.27.0BioRadoperates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tabletRoche11836153001
Coomassie Brilliant Blue RSigmaB0149
Dithiothreitol (DTT)Dot ScientificDSD11000
Econo-Column glassBioRad7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)Dot ScientificDSE57020
Flow adaptorBioRad7380014
GlycerolDot ScientificDSG22020
ImidazoleDot ScientificDSI52000
MethanolFisher ScientificA412
Mini PROTEAN TGX gelsBioRad4561084
NGC Chromatography SystemBioRadautomated liquid chromatography system 
Ni-NTA AgaroseQiagen1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluorideDot ScientificDSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards BioRad1610374
Sodium chlorideDot ScientificDSS23020
TALON metal affinity resinTakara635502
Tris BaseDST60040

References

  1. Balakrishnan, L., Bambara, R. A. Flap endonuclease 1. Annu Rev Biochem. 82, 119-138 (2013).
  2. Asagoshi, K. FEN1 functions in long patch base excision repair under conditions of oxidative stress in vertebrate cells.

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Parole chiave Proteina marcata 6X HisPurificazione per affinitCromatografia liquida rapida delle proteine FPLCEndonucleasi 1 del lembo FEN1Espressione proteicaPurificazione delle proteineStabilit delle proteineFunzionalit delle proteinePreparazione del campioneImpacchettamento della colonnaPortataParametri di eluizioneAnalisi del cromatogrammaConservazione delle proteine ricombinanti

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