Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida

Summary

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Abstract

A caracterização funcional das proteínas requer que elas sejam expressas e purificadas em quantidades substanciais com alta pureza para realizar ensaios bioquímicos. O sistema de Cromatografia Líquida de Proteína Rápida (FPLC) permite a separação de alta resolução de misturas complexas de proteínas. Ao ajustar vários parâmetros no FPLC, como selecionar a matriz de purificação apropriada, regular a temperatura da amostra de proteína e gerenciar a taxa de fluxo da amostra na matriz e a taxa de eluição, é possível garantir a estabilidade e a funcionalidade da proteína. Neste protocolo, demonstraremos a versatilidade do sistema FPLC para purificar a proteína 6X-His-tagged flap endonuclease 1 (FEN1), produzida em culturas bacterianas. Para melhorar a eficiência da purificação de proteínas, vamos nos concentrar em várias considerações, incluindo empacotamento e preparação adequados da coluna, injeção de amostra usando um loop de amostra, taxa de fluxo de aplicação da amostra na coluna e parâmetros de eluição da amostra. Finalmente, o cromatograma será analisado para identificar frações contendo altos rendimentos de proteína e considerações para armazenamento adequado de proteína recombinante a longo prazo. A otimização dos métodos de purificação de proteínas é crucial para melhorar a precisão e a confiabilidade da análise de proteínas.

Introduction

Inúmeras estratégias estão disponíveis para compreender a biologia celular. Uma abordagem envolve uma estratégia de cima para baixo, em que mutações genéticas são introduzidas em um gene, seguidas pela avaliação das mudanças fenotípicas resultantes em um organismo modelo. Por outro lado, uma abordagem reducionista envolve a elucidação inicial dos mecanismos moleculares e funções enzimáticas de uma determinada proteína, acompanhada pela caracterização de suas interações com outros componentes celulares. Posteriormente, avalia-se o impacto dessa proteína em uma via biológica. Embora cada abordagem de pesquisa possua suas vantagens e lim....

Protocol

1. Preparação da amostra

1. Para purificar FEN1 recombinante, expresse a construção (pET-FCH-FEN1) em células BL21 (DE3) conforme descrito anteriormente por Ononye et ^al.8.
   1. Inocular o meio LB (Tabela 1) com 1% de cultura durante a noite e fazer crescer as células a 37 °C até que a DO atinja 0,6.
   2. Induza com 0,4 M de isopropil-beta-D-tiogalactosídeo (IPTG) e cultive a cultura por mais 3 h.

Discussion

A cromatografia de afinidade é uma técnica amplamente utilizada para purificar proteínas de ligação ao DNA. A cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) é um tipo específico de cromatografia de afinidade que usa íons metálicos para capturar os resíduos de histidina de uma sequência de peptídeos. É por isso que a "etiqueta 6X-His" ou "etiqueta poli-His" é anexada ao terminal N ou ao terminal C das proteínas a serem purificadas. O níquel e o cobalto são os íon.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli sample buffer	BioRad	1610747
Acetic acid	Merck	UN2789
Beta-mercaptoethanol (BME)	Sigma	M-6250
Chromlab software version 6.1.27.0	BioRad		operates the NGC system
Complete MINI protease inhibitor tablet	Roche	11836153001
Coomassie Brilliant Blue R	Sigma	B0149
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000
Econo-Column glass	BioRad	7371512
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020
Flow adaptor	BioRad	7380014
Glycerol	Dot Scientific	DSG22020
Imidazole	Dot Scientific	DSI52000
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mini PROTEAN TGX gels	BioRad	4561084
NGC Chromatography System	BioRad		automated liquid chromatography system
Ni-NTA Agarose	Qiagen	1018244
Phenyl-methyl-sulfonyl fluoride	Dot Scientific	DSP20270
PreScission Plus Protein Dual Color Standards	BioRad	1610374
Sodium chloride	Dot Scientific	DSS23020
TALON metal affinity resin	Takara	635502
Tris Base		DST60040