Aqui, é descrito um protocolo para gerar padrões proteicos regulados por luz e reversíveis com alta precisão espaço-temporal em membranas lipídicas artificiais. O método consiste na fotoativação localizada da proteína iLID (dímero induzível por luz melhorado) imobilizada em membranas modelo que, sob luz azul, se liga à sua proteína parceira Nano (SspB do tipo selvagem).
A localização precisa e a ativação de proteínas na membrana celular em um determinado momento dão origem a muitos processos celulares, incluindo polarização, migração e divisão celular. Assim, métodos de recrutamento de proteínas para modelar membranas com resolução subcelular e alto controle temporal são essenciais na reprodução e controle de tais processos em células sintéticas. Aqui, é descrito um método para a fabricação de padrões de proteínas reversíveis reguladas pela luz em membranas lipídicas com alta precisão espaço-temporal. Para isso, imobilizamos a proteína fotocomutável iLID (dímero induzível por luz melhorado) em bicamadas lipídicas suportadas (SLBs) e na membrana externa de vesículas unilamelares gigantes (GUVs). Após a iluminação da luz azul local, o iLID se liga ao seu parceiro Nano (SspB do tipo selvagem) e permite o recrutamento de qualquer proteína de interesse (POI) fundida ao Nano da solução para a área iluminada na membrana. Essa ligação é reversível no escuro, o que fornece ligação dinâmica e liberação do POI. No geral, este é um método flexível e versátil para regular a localização de proteínas com alta precisão no espaço e no tempo usando luz azul.
A formação de padrões proteicos nas membranas celulares dentro das regiões subcelulares dá origem a vários processos biológicos, incluindo migração, divisão e comunicação localizada célula a célula 1,2. Esses padrões de proteína são regulados no espaço e no tempo e são altamente dinâmicos. Replicar esses padrões de proteínas em células sintéticas é essencial para imitar os processos celulares que surgem delas e para obter uma melhor compreensão de como essa regulação funciona em nível molecular. Análogo ao que é observado para membranas em células vivas, os métodos para gerar padrões de proteínas em membranas artificiais devem capturar sua dinâmica e fornecer controle espaço-temporal preciso.
Dentre vários estímulos, a luz se destaca por proporcionar o maior controle espaço-temporal e várias vantagens adicionais3. Através da regulação com luz, é fácil iluminar uma área desejada a qualquer momento desejado com precisão incomparável. Além disso, a luz fornece alta sintonia como a intensidade da luz e as durações do pulso podem ser ajustadas. Além disso, a luz visível é inofensiva para as biomoléculas, incluindo proteínas, e é possível até abordar múltiplas funcionalidades com diferentes comprimentos de onda. Assim, abordagens responsivas à luz baseadas na luz visível surgem como caminhos promissores para a regulação controlada e biortogonal dos padrões de proteínas no espaço e no tempo 4,5,6. A utilização de pares de proteínas fotocomutáveis da optogenética, atuando como dimerizadores induzíveis por luz, fornece um método direto para recrutar proteínas específicas para as membranas. Em particular, os padrões de proteínas foram formados com sucesso em membranas artificiais usando a interação desencadeada por luz azul entre iLID (dímero induzível por luz melhorado, com base no domínio LOV2 fotocomutável de Avena sativa) e Nano (SspB de tipo selvagem) 7 , 8 , o sistema SpyTag induzível por luz azul (BLISS) 9 , o tetrâmero de proteína responsiva à luz verde CarH10 e a interação induzível por luz vermelha entre PhyB e PIF 611.
Foi demonstrado que a interação fotocomutável entre iLID e Nano5 pode ser usada para foto-padronizar proteínas em membranas modelo usando luz azul7. A interação iLID/Nano é reversível no escuro, altamente específica e opera em condições fisiológicas. A ancoragem do iLID em modelos de membrana lipídica, como vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ou bicamadas lipídicas suportadas (SLBs), permite o recrutamento regulado pela luz de Nano para essas membranas, o que é reversível no escuro. Notavelmente, observamos que a introdução de um domínio desordenado no terminal N do iLID (resultando em uma proteína chamada disiLID) como uma ligação a uma membrana lipídica modelo aumenta a eficiência do recrutamento de Nano e a dinâmica de reversão8.
Ao empregar a interação disiLID/Nano, desenvolvemos um método para gerar padrões de alto contraste de proteínas de interesse (POI) nanofundidas em SLBs e nas membranas externas de GUVs. Este método permite a criação de padrões de proteínas com notável resolução espacial e temporal e alta reversibilidade em minutos. O protocolo detalhado descreve o processo de recrutamento local de proteínas em membranas artificiais. Especificamente, isso é conseguido imobilizando uma versão biotinilada de disiLID em SLBs e GUVs por meio da interação biotina-estreptavidina (SAv). Posteriormente, o Nano marcado com fluorescência (mOrange-Nano) é recrutado para essas membranas funcionalizadas disiLID sob iluminação de luz azul. Nosso protocolo experimental oferece uma abordagem direta e adaptável para obter o recrutamento de proteínas localizadas para as membranas. É importante ressaltar que essa metodologia não se limita às interfaces SLB e GUV relatadas ou mOrange-Nano; pode ser estendido a outros materiais e proteínas funcionalizados com disiLID fundidos ao Nano.
1. Preparação experimental
2. Recrutamento de mOrange-Nano para SLBs funcionalizados disiLID
3. Preparação de GUVs
4. Recrutamento mOrange-Nano para GUVs funcionalizados disiLID
Os procedimentos descritos permitem a formação de SLBs para recrutar mOrange-Nano nas membranas sintéticas. A formação de mOrange-Nano definido padronizado nos SLBs funcionalizados com b-disiLID é mostrada na Figura 1A. Como uma região de interesse (ROI) quadrada (24 μm × 24 μm) no SLB é iluminada com luz azul de 488 nm, um rápido aumento do sinal de fluorescência é observado no canal mOrange (mostrado em vermelho) no ROI dentro de 200 s. O padrão mostra bordas muito definidas e nítidas (Figura 1B), indicando alto controle espacial sobre a área fotoativada. A interação é rápida e totalmente reversível, pois a iluminação com luz azul é interrompida. Este método também permite a formação de padrões ao longo de vários ciclos de iluminação (Figura 2). Ciclos alternados de ~ 200 s de luz azul e 200 s de escuridão levam ao recrutamento reversível de mOrange-Nano na área selecionada por várias vezes com valores comparáveis de intensidade Δ de fluorescência nos padrões.
A Figura 3 mostra a representação esquemática da preparação dos GUVs. O recrutamento de mOrange-Nano também é observado em GUVs. É mostrado que os GUVs colocados no escuro não exibem fluorescência mOrange ( Figura 4A ). Como os GUVs são iluminados globalmente com luz azul, a fluorescência mOrange é observada, colocalizando com o corante de membrana GUV (DiD). A interação é altamente reversível, pois a iluminação é encerrada. A quantificação da intensidade de mOrange na membrana GUV ao longo do tempo mostra o recrutamento rápido e eficaz de proteínas, bem como a reversibilidade total ( Figura 4B ).
Figura 1: Imagens de microscopia de fluorescência de SLBs funcionalizadas com b-disiLID. As imagens de fluorescência na presença de mOrange-Nano antes (A) e durante (B) a iluminação local de luz azul (488 nm) na ROI. Barra de escala = 20 μm. (C) Intensidade de fluorescência de mOrange medida na ROI para SLBs funcionalizados com b-disiLID (a = 200 s). A figura é adaptada de Di Iorio et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Intensidade de fluorescência de mOrange recrutado no ROI em SLBs decorados com b-disiLID durante três ciclos de recrutamento. Após cada etapa de fotoativação, a fluorescência mOrange-Nano aumentou dentro da ROI. O padrão atinge a saturação em 120 s e a fluorescência diminui em 120 s, quase para níveis de fundo. Nenhuma perda de qualidade do padrão é observada em diferentes ciclos de luz azul/escuridão. A figura é adaptada de Di Iorio et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática da preparação dos GUVs usando o método de hidratação suave. O esquema oferece uma representação visual dos vários degraus e da câmara construída usando duas lâminas de vidro e um espaçador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Medições de microscopia de fluorescência do recrutamento dependente de luz de mOrange-Nano em membranas GUVs. (A) Imagens de fluorescência de um GUV funcionalizado com disiLID na presença de mOrange-Nano. Em verde está o corante de membrana dos GUVs, e em vermelho está a fluorescência mOrange antes, durante e depois da iluminação da luz azul. Barras de escala = 10 μm. (B) Intensidade de fluorescência de mOrange localizada no GUV ao longo do tempo. Após a iluminação, a fluorescência mOrange (mostrada em vermelho) na membrana lipídica atinge a intensidade máxima em 60 s, com um aumento de 5,9 vezes na intensidade da fluorescência. À medida que a iluminação é interrompida, a fluorescência mOrange diminui para valores quase pré-iluminação em 60 s (com uma recuperação de 90%). A figura é adaptada de Di Iorio et al.8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Descrevemos um método para o recrutamento localizado de proteínas mOrange-Nano em membranas modelo, como bicamada lipídica suportada e vesículas unilamelares gigantes usando a proteína fotocomutável disiLID8. Aspectos que contribuem para a qualidade do padrão incluem a qualidade das proteínas, bem como a boa qualidade dos SLBs e GUVs.
Para garantir uma boa qualidade proteica após a expressão e purificação, é importante primeiro avaliar as propriedades fotocomutáveis do disiLID. Para isso, a absorção do cofator FMN deve ser medida no escuro e após a iluminação da luz azul. Espera-se que os espectros UV-Vis do disiLID mostrem o pico triplo característico do cofator FMN no escuro, que diminui significativamente com a iluminação da luz azul e se recupera no escuro13. Esse comportamento fotocomutável é crucial para obter recrutamento reprodutível e reversível nas etapas a seguir. Trabalhar com luz vermelha protetora e expor o disiLID à iluminação externa mínima durante a preparação das amostras aumenta o desempenho dos experimentos.
Outra etapa crítica, e talvez a mais crucial, é a formação de SLBs adequados. Defeitos nas membranas e / ou a formação de SLBs não homogêneos (ou seja, a presença de SLBs multicamadas ou remendados) afetarão a qualidade do padrão de proteína. Portanto, para usuários inexperientes, recomenda-se reproduzir o protocolo rotulando os SUVs com alguns corantes de membrana, como DiD e DiO, a fim de formar SLBs marcados com fluorescência. Desta forma, as propriedades e a qualidade dos SLBs podem ser bem caracterizadas com microscopia de fluorescência. As medições FRAP representam uma abordagem típica para avaliar a qualidade de um SLB, avaliando a fluidez das membranas. Alternativamente, no caso de SLBs biotinilados, como os descritos neste protocolo, o SAv marcado com fluorescência (por exemplo, Atto 488-SAv) pode ser usado para visualizar e avaliar a qualidade dos SLBs.
A primeira parte do protocolo descreve a formação de padrões em SLBs. Para garantir um resultado ideal, é importante adicionar mOrange-Nano aos SLBs e deixar a amostra incubar no escuro por 15 min. Durante a fotoativação, a seleção do ROI não se restringe a um tamanho específico. No entanto, a intensidade do laser e o tempo de exposição precisam ser regulados para reduzir o fotobranqueamento indesejado das proteínas fluorescentes.
Este método não se restringe a proteínas biotiniladas, e outras abordagens podem ser usadas para ancorar disiLID em SLBs. Por exemplo, o disiLID marcado com His pode ser expresso e ancorado em SLBs contendo Ni-NTA. No entanto, é crucial expressar Nano e disiLID com tags diferentes para evitar a substituição das proteínas nos SLBs. Este método também permite a possibilidade de inverter a ordem das proteínas, funcionalizando assim SLBs com Nano e recrutando disiLID (ou proteínas fundidas com disiLID) após iluminação de luz azul.
Para o controle dinâmico da localização da proteína, a localização reversível da proteína na região selecionada deve ser possível repetidamente. Para conseguir isso, a concentração de Nano (200 nM) na solução é um parâmetro crítico para obter alta reversibilidade.
Outra preocupação é o recrutamento de Nano para a superfície GUV funcionalizada com disiLID. Como no caso da padronização de proteínas em SLBs, esse método pode ser estendido a diferentes estratégias de funcionalização de membranas. Neste protocolo, todo o GUV foi iluminado com luz azul para recrutar mOrange-Nano em toda a superfície do GUV. No entanto, a seleção de pequenas ROIs localizadas na membrana GUV deve levar à localização precisa de proteínas em uma área mais restrita.
Este método apresenta apenas uma limitação relacionada à escolha do fluoróforo empregado para a imagem do recrutamento de Nano na membrana dos SUVs ou GUVs. Em particular, fluoróforos com um espectro de excitação na faixa de luz azul devem ser evitados, pois seu uso interferirá na fotoativação do (dis)iLID. Portanto, a escolha de fluoróforos na faixa de luz verde ou vermelha (por exemplo, mOrange ou Cy5) é recomendada para este tipo de experimento.
O design disiLID oferece uma maneira simples e adaptável de melhorar o recrutamento local de proteínas para as membranas e amplia a faixa dinâmica do iLID e Nano da optogenética4. Esses métodos se concentram no recrutamento de Nano em membranas mímicas, como bicamadas lipídicas e GUVs. No entanto, esta abordagem é extensível às inúmeras ferramentas optogenéticas em células onde (dis)iLID ou Nano estão ligados a uma membrana.
Este trabalho foi financiado pelo European Research Council ERC Starting Grant ARTIST (# 757593 S.V.W.). A DDI agradece à Fundação Alexander von Humboldt por uma bolsa de pós-doutorado.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µ-Slide 18 Well | Ibidi | 81817 | For SLB preparation |
25 µL Microliter Syringe | Hamilton | Model 702 N | For the preparation of lipid mixture and spreading the lipid solution on the PVA layer |
Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl)) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 870273C | For SUVs preparation |
CaCl2 (Calcium chloride) | Sigma-Aldrich | C5670 | For SLB formation |
Cover Slips 24 mm x 60 mm | Engelbrecht | K12460 | For GUVs formation |
DiD (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'- Tetramethylindodicarbocyanine) | Thermo Fisher Scientific | D7757 | Membrane dye |
disiLID | Sequence: MGGSGLNDIFEAQKIEWHEGGSH HHHHHGSMAATELRGVVGPGPAA IAALGGGGAGPPVGGGGGRGDA GPGSGAASGTVVAAAAGGPGPG AGGVAAAGPPAPPTGGSGGSGA GGSGSAGEFLATTLERIEKNFVIT DPRLPDNPIIFASDSFLQLTEYSR EEILGRNCRFLQGPETDRATVRK IRDAIDNQTEVTVQLINYTKSGKK FWNVFHLQPMRDYKGDVQYFIG VQLDGTERLHGAAEREAVMLIKK TAFQIAEAANDENYF | ||
DOPC (1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphocholine) | Avanti Polar Lipids | 850375P | For SUVs lipid composition |
Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes | Merk | EP0030108116-100EA | For collecting freshly made GUVs |
mOrange-Nano | Sequence: MRGSHHHHHHGSKIEEGKLVI WINGDKGYNGLAEVGKKFEKDT GIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLA EITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYN GKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNP PKTWEEIPALDKELKAKGKSALM FNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKY ENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTF LVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFN KGETAMTINGPWAWSNIDTSKVN YGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSA GINAASPNKELAKEFLENYLLTDE GLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELA KDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQM SAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEA LKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGI EGTTENLYFQGSVSKGEENNMAI IKEFMRFKVRMEGSVNGHEFEIE GEGEGRPYEGFQTAKLKVTKGG PLPFAWDILSPQFTYGSKAYVKH PADIPDYFKLSFPEGFKWERVMN FEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYK VKLRGTNFPSDGPVMQKKTMG WEASSERMYPEDGALKGEIKMR LKLKDGGHYTSEVKTTYKAKKPV QLPGAYIVGIKLDITSHNEDYTIVE QYERAEGRHSTGGMDELYKGG SGTSSPKRPKLLREYYDWLVDN SFTPYLVVDATYLGVNVPVEYVK DGQIVLNLSASATGNLQLTNDFIQ FNARFKGVSRELYIPMGAALAIYA RENGDGVMFEPEEIYDELNIG | ||
NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 | For buffer |
NaOH (Sodium hydroxide) | Sigma-Aldrich | 1064980500 | For surface activation in SLB formation |
POPC (1-Palmitoyl-2- oleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar Lipids | 850457C | For GUVs lipid composition |
POPG (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-racglycerol)) | Avanti Polar Lipids | 840457C | For GUVs lipid composition |
PVA (Polyvinyl alcohol) fully hydrolyzed | Sigma-Aldrich | 8148940101 | For GUVs formation |
SP8 confocal laser scanning microscope | Leica | ||
Streptavidin | TermoFisher | 434301 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | For GUVs formation |
Tris hydrochloride | Sigma-Aldrich | 10812846001 | For buffer |
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