Strategie per migliorare la coltivazione di batteri anaerobici dal tratto gastrointestinale del pollo

Summary

Il protocollo presenta due metodologie per migliorare l'isolamento dei batteri intestinali anaerobi. Il primo si concentra sull'isolamento di una vasta gamma di batteri utilizzando diversi terreni di coltura. La seconda si concentra sulle fasi di coltivazione di uno specifico gruppo microbico, possibilmente assimilando il mio-inositolo, per comprenderne appieno il significato ecologico.

Abstract

Il tratto gastrointestinale (GIT) del pollo è un ecosistema complesso che ospita trilioni di microbi che svolgono un ruolo fondamentale nella fisiologia dell'ospite, nella digestione, nell'assorbimento dei nutrienti, nella maturazione del sistema immunitario e nella prevenzione dell'intrusione di agenti patogeni. Per una salute e una produttività ottimali degli animali, è imperativo caratterizzare questi microrganismi e comprenderne il ruolo. Sebbene il GIT del pollame contenga un serbatoio di microrganismi con potenziali applicazioni probiotiche, la maggior parte della diversità rimane inesplorata. Per migliorare la nostra comprensione della diversità microbica non coltivata, sono necessari sforzi concertati per portare questi microrganismi in coltura. L'isolamento e la coltivazione di microrganismi che colonizzano il GIT producono materiale riproducibile, tra cui cellule, DNA e metaboliti, offrendo nuove informazioni sui processi metabolici nell'ambiente. Senza la coltivazione, il ruolo di questi organismi nei loro ambienti naturali rimane poco chiaro e limitato a un livello descrittivo. Il nostro obiettivo è quello di implementare strategie di coltivazione volte a migliorare l'isolamento di una vasta gamma di microbi anaerobi dal GIT del pollo, sfruttando le conoscenze multidisciplinari della fisiologia animale, della nutrizione animale, della metagenomica, della biochimica dei mangimi e delle moderne strategie di coltivazione. Inoltre, miriamo a implementare l'uso di pratiche adeguate per il campionamento, il trasporto e la preparazione dei terreni, che sono note per influenzare il successo dell'isolamento. Metodologie appropriate dovrebbero garantire un ambiente costantemente privo di ossigeno, condizioni atmosferiche ottimali, un'adeguata temperatura di incubazione dell'ospite e la fornitura di requisiti nutrizionali specifici in linea con le loro esigenze distintive. Seguendo queste metodologie, la coltivazione non solo produrrà risultati riproducibili per l'isolamento, ma faciliterà anche le procedure di isolamento, favorendo così una comprensione completa dell'intricato ecosistema microbico all'interno del GIT del pollo.

Introduction

La rinascita della coltivazione nello studio dei microrganismi ha integrato le intuizioni degli studi metagenomici fornendo materiale per testare ipotesi metaboliche che in precedenza erano state descritte e quantificate solo parzialmente. La coltivazione di batteri intestinali fornisce materiale per sostenere la ricerca futura sulle interazioni microbico-ospite, facilitare studi di colonizzazione mirati e migliorare gli studi di interazione molecolare ^1,2,3. Le conoscenze acquisite sui microrganismi gastrointestinali hanno migliorato la nutr....

Protocol

Il protocollo è diviso in quattro parti: campionamento, isolamento batterico, identificazione e conservazione dei microrganismi ottenuti. Le autorizzazioni approvate per l'uso degli animali sono state rilasciate dalla commissione etica del Regierungspräsidium Tübingen, in Germania, con i numeri di approvazione HOH50/17 TE e HOH67-21TE.

1. Ottenimento di campioni per la coltivazione di batteri anaerobi

1. Mantenimento degli animali

Discussion

Lo scopo di questa metodologia è quello di migliorare la coltivazione di batteri intestinali anaerobici migliorando la qualità delle condizioni di campionamento, l'elaborazione dei campioni e la formulazione e la preparazione dei terreni. Le condizioni fisico-chimiche dei campioni (pH, disponibilità di carbonio, azoto e cofattori) devono essere prese in considerazione durante la formulazione dei terreni di coltura. Rispetto alle raccolte di colture batteriche ottenute da suini, esseri.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	VWR	20104.334
Agar	VWR	97064-332
Ammonium chloride	Carl Roth	P726.1
Anaerobic station	Don Whitley Scientific	A35 HEPA
Butyric acid	Merck	8.0045.1000
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Chicken lysozyme (Muramidase)	VWR	1.05281.0010
Cysteine	VWR	97061-204
Dextrose	VWR	90000-908
Di-potassium hydrogen phosphate	Carl Roth	P749.1
EDTA	Carl Roth	8043.2
Legehennen/ Junghennenfutter	Deutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Düsseldorf, Germany	-
MagAttract HMW DNA Kit	Qiagen	67563
Magnesium chloride	Carl Roth	2189.1
Mixed gas (80% N2 (quality level 5.0), 15% CO2 (quality level 3.0) and 5% H2 (quality level 5.0))	Westfalen Gase GmbH, Germany	-
Mutanolysin, recombinant (lyophilisate)	A&A Biotechnology	1017-10L
Myo-inositol	Carl Roth	4191.2
PBS 1X	ChemSolute	8418.01
Potassium dihydrogen phosphate	Carl Roth	3904.2
Propionic acid	Carl Roth	6026.1
QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2671
RNAse A	QIAGEN Ribonuclease A (RNase A)	19101
Sodium chloride	VWR	27800.291
Sodium resazurin	VWR	85019-296
Sodium thioglycolate	Sigma-Aldrich	102933
Soy Peptone, GMO-Free, Animal-Free	VWR	97064-186
Thermocycler	Bio-Rad	T100
Tryptone	Carl Roth	8952.1
Tween80	Carl Roth	9139.2
Vitamin mix (supplement)	VWR	968290NL
Vortex	Star Lab	07127/92930
Yeast Extract	Carl Roth	9257.05
β-D-Fructose	VWR	53188-23-1