הערכה גליקולית-איכותית מהירה של חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכת אוטומטית לחלוטין

Summary

בעבר פותחה מערכת לניתוח אוטומטי ומהיר של גליקנים על חלבונים. מאמר זה מציג את הפרוטוקול ל"ניתוח גליקו-איכותני", המותאם למגוון רחב של משתמשים, כגון אלה העוסקים בניתוח מבנים גליקניים בביו-פרמצבטיקה ובחומרים גליקוקו-מצומדים אחרים.

Abstract

גליקוזילציה של חלבונים, שינוי קריטי לאחר תרגום, משפיעה על היציבות, היעילות והאימונוגניות של חלבונים רקומביננטיים, כולל תרופות ביולוגיות. מבנים גליקניים מפגינים הטרוגניות משמעותית, המשתנה בהתאם לסוגי תאי הייצור, תנאי התרבית ושיטות הטיהור. כתוצאה מכך, ניטור והערכה של מבני גליקן של חלבונים רקומביננטיים הוא חיוני, במיוחד בייצור ביו-פרמצבטי. מיקרו-מערך לקטין (lectin microarray), טכניקה משלימה לספקטרומטריית מסות, מתהדר ברגישות גבוהה ובקלות שימוש. עם זאת, זה בדרך כלל לוקח יותר מיום כדי להניב תוצאות. כדי להתאים אותו למחקר שאינו גליקו-מדעי או לפיתוח תהליכי מוצר תרופתי, יש צורך בחלופה אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה. לכן, פותחה מערכת פרופיל הגליקן האוטומטית המלאה הראשונה בעולם, המשתמשת בקונספט הטכנולוגי "מערך חרוזים בקצה יחיד (BIST)". מערכת זו מאפשרת הכנה ואחסון של חרוזי לקטין משותקים ביחידות של 1,000, עם הזמנות החדרה מקבילות הניתנות להתאמה אישית למטרות שונות. מאמר זה מציג פרוטוקול מעשי למחקר המערב חלבונים רקומביננטיים "מוסמכים גליקו". לאחר בדיקת תגובתיות שלהם כנגד 12 מצומדים פוליאקרילאמיד-גליקן, נבחרו 15 לקטינים כדי להגביר את הרבגוניות של המערכת. בנוסף, תהליך תיוג הדגימה עבר אופטימיזציה על ידי מעבר מ-Cy3 לביוטין, מה שהפחית את זמן העיבוד הכולל ב-30 דקות. לקבלת אישור נתונים מיידי, אותות קושרי לקטין מוצגים כקוד נקודה בצג העליון. אמינות המערכת אושרה באמצעות בדיקות שחזור יומיומיות, בדיקות חזרתיות ובדיקות אחסון ארוכות טווח, עם מקדם שונות של <10%. למנתח גליקו מהיר וידידותי למשתמש זה יש יישומים פוטנציאליים בניטור האיכות של גליקופרוטאינים אנדוגניים לצורך הערכה ואימות של סמנים ביולוגיים. שיטה זו מאפשרת ניתוח עבור אלה חדשים במדע הגליקו, ובכך מרחיבה את התועלת המעשית שלה.

Introduction

גליקוזילציה של חלבונים היא שינוי חיוני לאחר התרגום שיש להעריך בתרופות ביולוגיות. פרופילי הגליקן של חלבונים יכולים להשתנות בהתאם לתנאי התרבית, תהליכי הטיהור והתאים המארחים¹. מכשירים פשוטים נדרשים כדי לאשר גליקוזילציה בתוך צינור התהליך הביולוגי. ההערכה היא כי מעל 50% מהחלבונים המופרשים והממברנות in vivo משתנים עם גליקנים מרובים, המשתנים בהתאם לשושלת התא, השלב ההתפתחותי ומצב המחלה, כגון הופעת ממאירות². ניטור פרופילי גליקן טומן בחובו פוטנציאל משמעותי לזיהוי סמנים אבחוניים ייחודיים ומטרות תרופתיות. מכשירים אוטומטיים המסוגלים למדוד במהירות דגימות בקנה מידה גדול מבוקשים מאוד כדי לאמת ולאמת גליקוזילציה חריגה כזו ממאות דגימות חולים בצנרת הגילוי.

טכנולוגיית Microarray שולבה בגליקומיקס להערכת פרופיל גליקן של גליקופרוטאינים³. בשיטה זו, מספר לקטינים, שהם חלבונים קושרי גליקן, משותקים על משטח כגון מגלשת זכוכית. טכנולוגיית ניתוח גליקנים מבוססת אינטראקציה זו אינה מחייבת שחרור גליקנים מחלבוני ליבה מראש, מה שמפשט את התהליך עבור חוקרים חדשים בתחום הגליקוטכנולוגיה. למרות השימוש הנרחב בה, עבור יישומים תעשייתיים כגון ייצור ביולוגי, נדרשה מערכת אוטומטית המסוגלת לנטר גליקנים במהירות ובקלות עבור מספר גדול יותר של יעדי ניתוח. כדי להתמודד עם זה, דווח בעבר על מערכת פרופיל גליקן אוטומטית המבוססת על מושג ייחודי המכונה "מערך חרוזים בקצה יחיד" (BIST), שפותחה במקור עבור גנוטיפ. מערכת זו מפשטת את התהליך עם מכשיר אוטומטי בעל תפוקה גבוהה מסוג קופסה אחת⁴. באמצעות קצוות שבהם מסודרים חרוזים קבועים בלקטין שונים במקביל ^4,5, הוקמה שיטה לניתוח מבני גליקן שהשתנו בגליקופרוטאינים ונקראה GlycoBIST (להלן "מערכת פרופיל גליקן אוטומטית") (איור 1A). ניתן לקבע לקטין על 1,000 חרוזים ולייבש אותו כדי לשמור על פעילות במשך שנה, גם לפני וגם אחרי האריזה בחוד. לאחר שקצוות ומחסניות המכילים ריאגנטים כגון נוגדן אנטי-סטרפטאבידין (SA-HRP) המסומן על-ידי HRP מוגדרים במכשיר האבטיפוס של המדידה (התקן למדידת תגובה אוטומטית, ראו טבלת חומרים), החוד מתפקד כאוטופיפטה. סורק זיהוי כימילומינסנציה בחלק האחורי הפנימי של המכשיר מכמת את האותות של שמונה קצוות בו זמנית. הנתונים הכמותיים משמונת הטיפים הללו מוצגים באופן קומפקטי ובו-זמני כקודי נקודות במסך המגע של המכשיר לאישור מהיר של תוצאות המדידה. יתר על כן, הערך המיוצג כמקסימום של הפסגה הנמדדת מועבר מהמכשיר כנתונים גולמיים, והוא מאפשר גרפים על-ידי חוקרים בודדים (איור 1A, לוח תחתון).

במאמר זה, המחברים מתארים שיטה משופרת של תיוג חלבונים באמצעות ביוטין, המקצרת את זמן העיבוד ל-30 דקות. חלבוני המטרה עוברים ביוטינילציה מראש ומזוהים על-ידי SA-HRP (איור 1B). קצה GlycoBIST סטנדרטי (טיפ מיוחד לפרופיל גליקן אוטומטי) עם 15 לקטינים נבחרים נבנה כדי להשיג את פרופיל הגליקופרוטאין גליקן הרב-תכליתי להבנה אנליטית.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש למחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת הטיפ המיוחד לפרופיל גליקן אוטומטי

1. הביאו את החרוזים המיובשים הקבועים בלקטין, המאוחסנים ב -4 מעלות צלזיוס בשקית אטומה, לספסל ואפשרו להם לחזור לטמפרטורת החדר (~ 23 מעלות צלזיוס).
   הערה: פעולה זו מונעת עיבוי על החרוזים, מה שעלול לפגוע באיכותם. שיטה זו להכנת חרוזי קיבוע לקטין דווחה בעבר⁵.
2. הניחו מטלית אנטי-סטטית על השולחן והניחו את המבטל הסטטי הנייד מול סביבת העבודה. זה מאפשר לבצע את העבודה הבאה על הספסל עם הגנה אנטיסטטית (איור 2A).
3. הכניסו חרוזים לקצה הריק באמצעות פינצטה אנטיסטטית כך ששני חרוזי ספייסר ימוקמו בין החרוזים מקבעי הלקטין (איור 1A).
4. סחטו בעדינות את החלק העליון של הקצה עם פטמות כדי לסגור את הפתח, והיזהרו לא לחתוך את הקצה אחרי שכל החרוזים מולאו (איור 2B).
   הערה: פעולה זו נועדה לאבטח את החרוזים בתוך הקצה. מומלץ לעצב את הפטמה כדי למנוע חיתוך של הקצה (איור 2C).
5. יישרו את הקצה ביד אם הוא כפוף.
6. יש לאחסן את החוד המוכן בטמפרטורה של 4°C בשקית אטומה עם חומר ייבוש עד לצורך.
   הערה: לפני השימוש בטיפ, יש להביא אותו לטמפרטורת החדר לפני פתיחת השקית האטומה והוצאתה. הלחות מפחיתה באופן דרסטי את תגובתיות הלקטינים.

2. הכנת האנליטים

1. ארוז מראש את מגיב הביוטינילציה לניתוח שגרתי.
   הערה: לניתוח שגרתי, כדאי לארוז מראש את מגיב הביוטינילציה (Biotin-(AC₅)₂ Sulfo-Osu, ראה טבלת חומרים) במנות קטנות כדלקמן לניתוח מהיר. מומלץ לייבש ולאחסן את מגיב הביוטינילציה, שכן אסטר סוקסינימיל שלו רגיש בדרך כלל להידרוליזה.
   1. ממיסים את מגיב הביוטינילציה במים שעברו דה-יוניזציה.
   2. מוציאים 10 מיקרוגרם של מגיב לתוך צינורות באמצעות פיפטה.
   3. יבשו את הצינורות עם מגיב ביוטינילציה ברכז ואקום מקורר ואחסנו אותם עם חומר מייבש בטמפרטורה של 4°C בשקית אטומה לאור עד לשימוש.
2. הוסף את תמיסת האנליט (חלבון 200 ng eq) לצינור המכיל את מגיב הביוטינילציה המיובש שהוכן בשלב 2.1.
   הערה: שים לב להרכב החיץ המשמש להמסת ודילול האנליטים, בהתאם לתכונות מגיב הביוטינלציה המשמש. לדוגמה, הימנע משימוש בריאגנטים ראשוניים של אמין כמאגרים לצימוד אמין. זה ימנע ירידה ביעילות הביוטינילציה של האנליטים.
3. מערבבים היטב על ידי מערבולת, ואז מסתובבים כלפי מטה (1000 x גרם במשך 5 שניות בטמפרטורת החדר) בצנטריפוגה שולחנית כדי להפיל את הנוזל על המכסה לתחתית הצינור.
4. לדגור על הצינורות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
5. דללו את דגימות הביוטינילציה פי 10 במאגר ה-Probing (1% Triton X-100, 0.5 M Glycine, 1 mM CaCl₂ ו-1 mM MnCl₂ ב-TBS) כדי להשבית ריאגנטים של ביוטינילציה שלא הגיבו.
   הערה: במקרה של תגובות על ידי צימוד אמין, מגיב הביוטינילציה הבלתי מגיב נצרך על ידי התגובה עם חיץ המכיל מגיב אמין ראשוני כגון Tris in TBS, אשר מונע את הביוטינילציה של לקטינים וחומרים אחרים המשותקים על החרוזים במדידה הבאה.
6. יש לדגור בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור, למשך שעתיים.
7. להעריך את יעילות הביוטינילציה של האנליטים באמצעות כתמים מערביים, תוך שימוש בסטרפטאווידין המסומן על ידי HRP כבדיקת זיהוי במידת הצורך. עיין בספרות על שיטות הכתמה מערביות⁶.

3. הכנת ריאגנטים לפרופיל גליקן עם מכשיר מדידת התגובה האוטומטי

1. דללו את הסטרפטאווידין המצומד על ידי HRP בתמיסת החסימה ביחס של 1:3000.
2. מערבבים בנפחים שווים של מצע א' ומצע ב' (ראו טבלת חומרים). יש להשתמש ב-160 מיקרוליטר של מצע מעורב לדגימה.
3. יש להוציא את תמיסת החסימה, לשטוף חיץ (0.1% Triton X-100/TBS), TBS, תמיסת סטרפטאבידין מצומדת HRP, וכל מצע לבארות ייעודיות של מחסנית עם 10 מאגרים נוזליים.
   הערה: הנפח והמיקום המומלצים של פתרונות למילוי כל באר של מחסנית התגובה מתוארים להלן. עם זאת, ניתן לשנות את הפתרונות ואת סידור הבאר במכשיר מדידת התגובה האוטומטית בהתאם לצורך.
   1. הוסף 0.2 מ"ל של סטרפטאבידין עם תווית HRP שהוכן בשלב 3.1. לבאר #2 באמצעות פיפטה. הבאר נקראת #1 מקדמת המחסנית.
   2. הוסף 0.2 מ"ל של פתרון חסימה לבאר #3 באמצעות פיפטה.
   3. הוסף 1 מ"ל של TBS לבארות #4 ו #6 באמצעות פיפטה.
   4. הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה לבארות #7 ו #8 באמצעות פיפטה.
   5. הוסף 0.16 מ"ל של תערובת המצע לבאר #10 באמצעות פיפטה.
   6. אשר כי בארות #1, #5, ו #9 ריקים.
4. הוסף את האנליטים שהוכנו בשלב 2 למיקרו-צינור 2 מ"ל חלבון נמוך ספיגה בורג.
5. פתח את דלת הכניסה של התקן מדידת התגובה האוטומטי.
6. הגדר את המאגרים הנוזליים שהוכנו בשלב 3.3, את הקצוות שהוכנו ב-1 ואת האנליטים שהוכנו בשלב 3.4 במיקומים המיועדים של התקן מדידת התגובה האוטומטית (איור 2D) באופן הבא. כל מדידה מבוצעת בכיוון קו אנכי אחד.
   1. הניחו קצה אחד שהוכן בשלב 1 בכל חור במיקום הסמל הצהוב "a" באיור 2D.
      הערה: שוב, אם שומרים בקירור, הביאו את הטיפים לטמפרטורת החדר לפני פתיחת השקית האטומה. לקטינים מאבדים את האות שלהם באופן דרמטי בגלל לחות.
   2. הסר את מכסה הצינור המכיל את האנליט שהוכן בשלב 3.4 והכנס אותו לכל חור במיקום "b" באופן דומה.
   3. הכנס את המחסנית המכילה את הנוזל שהוכן בשלב 3.3, תוך זהירות שלא לשפוך אותו במיקום "c".
   4. הסירו את כל "קופסת האשפה" באיור 2D כשהיא מלאה, השליכו את תכולתה לפח האשפה והחזירו את "קופסת האשפה" למקומה המקורי.
      הערה: הטיפים שהגיבו נאספים באופן אוטומטי ב"קופסת האשפה" לאחר המדידה.

4. פרופיל גליקן עם מכשיר מדידת התגובה האוטומטי

1. הפעל את מתג ההפעלה בצד היחידה הראשית.
2. געו בכפתור "התחל אבחון" המוצג על המסך (איור 3A). תוכנית האבחון העצמי מופעלת באופן אוטומטי. לאחר זמן מה, תוכנית האבחון העצמי הושלמה, ומסך HOME מופיע (איור 3B).
   הערה: ניתן לבצע את הפעולות הבאות על-ידי נגיעה בסמלים המתאימים. "Assay" כדי להתחיל מדידה. "תחזוקה" כדי לאשר כל שגיאת מערכת. "היסטוריה" להצגת נתוני מדידה קודמים.
3. געו ב"Assay" המוצג במסך HOME כדי לבחור את הפרוטוקול (איור 3B).
4. בחר את "BAssaySTD" של שיטת הבדיקה (איור 3C) ולאחר מכן לחץ על "הבא" בפינה השמאלית התחתונה.
5. הזינו את שם הדגימה (איור 3D) עבור כל דגימה לפי הצורך ולאחר מכן געו ב"הבא" בפינה השמאלית התחתונה.
6. הזינו את שם הקצה (איור 3E) המשמש עבור כל דגימה לפי הצורך ולאחר מכן געו ב"הבא" בפינה השמאלית התחתונה.
7. אשרו את ההערות מימין (איור 3F), ואם אין בעיה, געו ב"התחל" בפינה השמאלית התחתונה למדידה.
8. אשרו את מעבר המסך למצב ריצה (איור 3G) והמתינו עד שהחץ "סיום" יסומן. במידת הצורך, גע ב"הפסק" כדי להפסיק את מצב ההפעלה.
   הערה: הפעולות הנשלטות באופן אוטומטי על-ידי התקן מדידת התגובה האוטומטי הן כדלקמן: (1) חרירי מיקרופיפטה אוטומטיים בתוך המכשיר מחברים עד שמונה קצוות בו זמנית (ראו את הסמל הצהוב "a" באיור 2D); (2) לשאוף/לפרוק שוב ושוב את התמיסה בצינור המכיל את האנליט למשך 5 דקות; (3) להעביר לתמיסת החסימה ולשאוף/לפרוק למשך 5 דקות; (4) העברה ל-TBS ושאיפה/פריקה למשך 2 דקות; (5) העברה לתמיסת סטרפטווידין המסומנת על-ידי תוכנית המענה ההומניטרי ושאיפה/פריקה למשך 5 דקות; (6) להעביר למאגר הכביסה ולשאוף/לפרוק למשך 7 דקות; (7) העברה ל-TBS ושאיפה/פריקה למשך 2 דקות; (8) להעביר לתערובת המצע ולשאוף בבת אחת; (9) לסרוק את הכימילומינסנציה של שמונה קצוות בו זמנית בגב המכשיר כדי לקבל נתוני שיא; (10) השליכו טיפים משומשים לארגז האשפה; (11) הזרבובית חוזרת למצב ההתחלתי.
9. ודא שהמסך השתנה למצב התוצאה (איור 3H) עם השלמת המדידה. שמונת קודי הנקודות מוצגים בו-זמנית על המסך לצורך אימות קל.
   הערה: גע ב"היסטוריה" בפינה השמאלית התחתונה כדי להציג את תרשים הסריקה (איור 3I,J), גרף עמודות (איור 3K,L), טבלה (איור 3M) ופרטים (איור 3N) כתוצאה על המסך. הצג את התוצאות מנתיבים אחרים מהרשימה הנפתחת "נתיב".
10. הכנס זיכרון USB ליציאת ה- USB בצד היחידה הראשית וגע ב"ייצוא" בפינה השמאלית התחתונה של מצב התוצאה כדי לשמור את הנתונים של כל הנתיבים בנפרד בזיכרון ה- USB.
11. יצא את הנתונים הגולמיים (איור 3M) כקובץ CSV באמצעות יציאת USB לניתוח נתונים נוסף ולגרפים בודדים ב- Excel. "ערך" של הטבלה מציין את עוצמת האות של כל לקטין. ערכי העוצמה מייצגים את הערך המרבי של נתוני השיא (איור 3I,J) בסריקה של קצוות שהגיבו.
    הערה: ניתן להגדיר את סף החילוץ המרבי. בהתאם לאנליטים, האות בחלק חרוזי הספייסר עשוי להיות גבוה יותר בסך הכל, ובמקרה זה הערך בחלק המרווח מופחת כרקע.

Discussion

במחקר זה פותחה טכניקת הערכה מהירה לגליקוזילציה המשתמשת בטכנולוגיית "מערך חרוזים בקצה אחד". המחקר הנוכחי הציג טיפ סטנדרטי של GlycoBIST, המיועד הן לחוקרי גליקוזילציה והן לחוקרים שאינם גליקוזיליים, כדי להקל על הערכת גליקוזילציה שגרתית ומקיפה. מיקרו-מערך לקטין (lectin microarray), המכיל בדרך כלל 20-100 לקטינים^12,13, נמצא בשימוש נרחב בהערכות. עם זאת, בהתחשב בייחודיות החופפת של חלק מהלקטינים במיקרו-מערך והמגוון המוגבל יחסית של גליקופורמים על גליקופרוטאין מטרה בהשוואה לגליקומיקס של דגימות קליניות גולמיות, היה צפוי כי 15 לקטינים יספיקו להערכה פשוטה יותר של פרופיל גליקן ממוקד.

השלב הקריטי בפרוטוקול הוא לאפשר לחרוזים המשותקים בלקטין או לקצוות המלאים בחרוזים אלה לחזור לטמפרטורת החדר לאחר האחסון לפני השימוש בהם למדידות. בפרט, נצפה כי עיבוי מחליש את האותות; לכן, מומלץ לא לפתוח את שקית האחסון עד שהיא חוזרת לטמפרטורת החדר. לאחסון ריאגנטים של ביוטינילציה, חיוני גם להתייבש לחלוטין לפני האחסון. תהליך ייבוש לא מספיק מפחית את יעילות הביוטינילציה לחלבון בגלל ההידרוליזה של מגיב הביוטינילציה¹⁴.

לגבי שינויים ופתרון בעיות, נבדקה שיטה לצמצום השונות, במיוחד בכל הנוגע לשיטת המדידה במכשיר מדידת התגובה האוטומטי. בפרט, כאשר נפח החיץ במאגר המשמש לניתוח הוא 150 μL, בועות נכנסות לקצה, מה שמוביל ליעילות תגובה מופחתת וכתוצאה מכך לשונות גדולה בערכים. לכן, מומלץ להציב לפחות 200 μL של חיץ במאגר.

כמות הנוזלים שממלאת את הקצוות במהלך פיפטינג אוטומטי היא גם גורם חשוב. הקצוות אינם יכולים לגרש לחלוטין את הנוזל כשהוא עובר לשלב התגובה הבא. לכן, בכמות לא קטנה, המאגר מהשלב הקודם מועבר לשלב הבא, והמאגר הקודם נשאר באזור העליון של התמיסה שהוכנסה כאשר שואפים את המאגר החדש. לכן, המצע ותמיסות אחרות צריכים להיות מספיק שואפים כדי למלא את המאגר העליון (ראו איור 1A). בהתחשב בחוסר ההפיכות של תגובות נוגדנים על המכשיר, חשוב לנקוט משנה זהירות ולהימנע מטעויות במהלך ההתקנה הראשונית.

מגבלה אחת של השיטה היא שהיא מוגבלת לחלבונים מסיסים שמקורם בסרום ובתרבית. בשיטה הנוכחית, לקטין אינו מקושר באופן קוולנטי לחרוז, ולכן הוא אינו מסוגל לנתח דגימות המכילות ריכוזים גבוהים של חומרים פעילי שטח, כגון תמציות תאים ורקמות. כתוצאה מכך, יש צורך בשיפורים עתידיים כדי להתמודד עם מגבלות אלה.

חשיבותו של מערך חרוזי הלקטין טמונה ביכולת ההחלפה וההרחבה של מיני הלקטין הקבועים על החרוזים. לדוגמה, בניתוח דיפרנציאלי בקנה מידה גדול (>1,000 דגימות) באמצעות מערכת פרופיל גליקן אוטומטית, משתמשים יכולים להתאים מערך של 15 לקטין בקצה בהתבסס על פרופיל גליקן ראשוני מבוסס מיקרו-מערך לקטין של גליקופרוטאין המטרה (<100 דגימות). יתר על כן, היציבות הגבוהה של חרוזי הלקטין הקבועים מאפשרת התנסות מיידית מתכנון החוד הראשוני ועד למדידה בהליכים שגרתיים. לא רק 25 מתוך 28 לקטינים שהוכיחו אמינות גבוהה (טבלה 1), אלא כל לקטין שמעניין את המשתמש יכול לשמש ליצירת מערכת פרופיל גליקן אוטומטית מותאמת אישית עבור הניסויים הספציפיים שלו, לאחר בדיקת האמינות השגרתית שהוזכרה לעיל. גישה זו הובילה לתכנון מערך חרוזים אפשרי של 120 לקטין של שמונה סוגים שונים של טיפים למדידה מורחבת בשילוב עם מערכת פרופיל גליקן סטנדרטית.

מחקר קודם התמקד בביסוס הליך זיהוי של גליקופרוטאינים בעלי תווית Cy3 בקנה אחד עם מיקרו-מערך^{לקטין 15}. שיטה זו הוגבלה ל-13 לקטינים במקביל בקצה בגלל הפרעות פלואורסצנטיות. השיטה הנוכחית, המשתמשת בתוויות זיהוי HRP, מכילה 15 חרוזים קבועים בלקטין ושני חרוזי ביקורת (חיוביים ושליליים) בקצה. בנוסף, biotinylation של דגימות קיצר את תהליך הניתוח.

שיטה אנליטית זו יכולה להיות מיושמת לא רק למחקר אקדמי, אלא גם למחקר רפואי ופרמצבטי, מזון, קוסמטיקה ותחומים תעשייתיים אחרים. בעוד שטכנולוגיות מיקרו-מערך לקטין וגליקופרוטאומיקה מבוססות היטב, הגישה של מחקר זה נותרה משמעותית עבור האוטומציה המלאה שלה ויכולתה לניתוח מהיר עם פחות צעדים. בעתיד, שיפורים בניתוח זה יבוצעו בשיטה כמותית על ידי נרמול האות באמצעות גליקופרוטאינים מסוימים, תוך שימוש בחרוזים קבועים נוגדנים לצד חרוזים קבועים לקטין בקצה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8 PCR tubes + flat cap	FastGene	FG-0028FC/SE	For dispensing and storage of biotin labeling reagents
2.0 mL SC Micro Tube protein LB	SARSTEDT AG&Co. KG	72.694.600	For loading samples in LuBEA-VIII
Analysis software	SAS Institute Inc.	JMP 17
Anti-Static Ionizer. 110 volts	Plas-Labs	800-AS/SPI	Use while inserting beads into BIST Tip.
Antistatic tweezers NK2A	RUBIS	9-5681-01	Use while inserting beads into BIST Tip.
Automated reaction measurement device	Precision System Science Co., Ltd.	LuBEA	All data in this study were obtained using LuBEA-VIII. While LuBEA is commercialized, LuBEA-VIII is currently in the development phase. The website for product details of LuBEA and LuBEA-VIII can be found at the following URL (https://www.pss.co.jp/english/technology/apit/bist02.html).
Biotin-(AC5)2 Sulfo-Osu	Dojindo	341-06801	As biotinilation reagent
BIST spacer bead- V-11	Precision System Science Co., Ltd.	F4938000	Diameter: 1 mm
BIST tip and sheath	Precision System Science Co., Ltd.	F4930-000	Fill this empty tip with beads.
Calcium chloride	Wako	039-00475	For preparing buffer solutions
Can Get Signal Solution 2	TOYOBO	NKB-301	This blocking reagent is good for this method
CentriVap Benchtop Vacuum Concentrators	Labconco	7810010	For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible.
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705060	For measuring the samples by LuVEA VIII
Cold trap CentriVap series	Labconco	7460040	For dry of biotinilation reagent. The substitution provided by other companies is possible.
Glycine	Wako	077-00735	For preparing buffer solutions
Manganese(II) Chloride Tetrahydrate	Wako	139-00722	For preparing buffer solutions
Milli-Q reference	MERCK	ZIQ7000T0C	As deionazed water for dilution of reagents and buffers
PBS	Wako	162-19321	For preparing buffer solutions
Peroxidase Streptavidin	Jackson	016-030-084	This antibody is good for GlycoBIST analysis. It is useful for the detection of the western blotting, although substitutions can be provided by other companies.
Probe bead	Precision System Science Co., Ltd.	FP4936000	For preparing lectin-fixed beads. See Shimazaki, H. et al., Current Protocols in Protein Science, 2020 in reference section for detail.
Protein LoBind Tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030108442	Use while preparing the samples such as biotinylation.
Silica gel (for desiccan)	Kanto chemical	37039-02	Use while storing the GlycoBIST tip and dried biotinylation reagent.
Static electricity removal sheet M	TRUSCO NAKAYAMA	SD5050	Use while inserting beads into BIST Tip.
SV Cartridge II	Daido Chemical Industry	ED041	For measuring the samples by LuVEA VIII
Table Microcentrifuge-CAPSULEFUGE	TOMY	PMC-060	For spin-down of the mixture in each process
Triton X-100	Nacalai tesque	35501-15	For preparing buffer solutions