Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Abstract

A sepse Gram-negativa (GN) é uma emergência médica em que o manejo em ambientes com recursos limitados depende de técnicas convencionais de cultura microbiológica que fornecem resultados em 3-4 dias. Reconhecendo esse atraso no tempo de resposta (TAT), tanto o EUCAST quanto o CLSI desenvolveram protocolos para determinar os resultados da AST diretamente de frascos de hemocultura automatizados sinalizados positivamente (+aBCs). O protocolo EUCAST rapid AST (RAST) foi introduzido pela primeira vez em 2018, onde podem ser relatados pontos de interrupção do diâmetro da zona para quatro agentes etiológicos comuns da sepse GN, ou seja, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complexo Acinetobacter baumannii . No entanto, os laboratórios clínicos que implementaram esse método em seu fluxo de trabalho de rotina dependem da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa, que não está facilmente disponível, impedindo assim sua implementação em ambientes com recursos limitados. Para contorná-lo, avaliamos um protocolo de inóculo direto (DIP) usando um sistema comercial automatizado de identificação microbiana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (aMIAST) para permitir a identificação microbiana precoce dentro de 8 h após a sinalização positiva de aBC. Avaliamos este protocolo de janeiro a outubro de 2023 para identificar os quatro GN relatáveis RAST (RR-GN) no aBC sinalizado positivamente. Os resultados da identificação microbiana na DIP foram comparados com o protocolo de preparação de inóculo padrão (SIP) em aMIAST. De 204 +aBCs com GN monomórfico (+naBC), um dos 4 RR-GN foi identificado em 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complexo A. baumannii : 26). Destes, 94% (98/105) foram corretamente identificados pelo DIP, enquanto as taxas de erro maior e muito maior foram de 6% (7/105) e 1,7% (4/240), respectivamente. Quando a DIP para identificação microbiana é feita usando o método EUCAST RAST, relatórios clínicos provisórios podem ser fornecidos dentro de 24 horas após o recebimento da amostra. Essa abordagem tem o potencial de reduzir significativamente o TAT, permitindo a instituição precoce de terapia antimicrobiana apropriada.

Introduction

A sepse, um importante problema de saúde global, é definida como disfunção orgânica com risco de vida devido a uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. O Global Burden of Diseases Study estimou que houve 48,9 milhões de casos de sepse e 11 milhões de mortes relacionadas à sepse em todo o mundo em 2017, o que representou quase 20% de todas as mortes globais1. Cercade 2 /3 das infecções da corrente sanguínea (ICS) que causam mortalidade são devidas a patógenos bacterianos gram-negativos2. As principais causas de mortalidade entre gram-negativos (GN) são Escherichia coli, Klebsiella pneumon....

Protocol

O estudo, financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pelo AIIMS Bhopal, foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana Institucional (IHEC) vide carta nº: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Um volume amostral de 5 ml foi utilizado com base nos estudos realizados por Quesada et al.25 e Munoz-Davila et al.27.

1. Protocolo de inóculo padrão (SIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

Representative Results

Resultados gerais
Durante o período do estudo, 240 +naBCs foram identificados por aMIAST usando DIP e SIP. Destes, 15% (36/240) +naBCs foram considerados polimicrobianos após incubação noturna no meio plaqueado. Dos 204 +naBCs, a proporção de NR-GN identificada pelo SIP foi de 51,5% (105/204). Dentre eles, 47,6% (50/105) eram E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa e 24,8% (26/105) complexo A. baumannii . Uma descrição detalhada de to.......

Discussion

Usando o DIP, identificamos com sucesso os RR-GNs com considerável precisão diagnóstica. O TTI médio após sinalização positiva de aBC foi de apenas 507 min (~ 8,5 h). Assim, quando feito em conjunto com o método EUCAST RAST para determinação de AST, ele pode fornecer identificação isolada em 8 h de tempo de leitura de AST. Esta abordagem tem o potencial de implementar o método EUCAST RAST, evitando a necessidade de identificação baseada em espectrometria de massa. Isso é uma bênção para os ambientes de.......

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

O estudo foi financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pela AIIMS Bhopal. Reconhecemos a contribuição dos técnicos de laboratório e médicos residentes que realizaram e leram os testes diligentemente durante o horário de rotina e emergência.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD035-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Amoxyclav disk (20/10 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD063-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Cefotaxime disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD295E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ceftazidime disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD062A-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Ciprofloxacin disk (5 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD060-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD010-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Gentamicin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD016-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Imipenem disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD073-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Levofloxacin disk 5 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD216-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Meropenem disk 10 µg Himedia, Mumbai, IndiaSD727-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)Himedia, Mumbai, IndiaSD292E-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
Tobramycin disk 10 µgHimedia, Mumbai, IndiaSD044-1VLAntimicrobial susceptibility testing 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota USA0335ARecommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France412CM8423Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, IndiaDFP-2/21-22/149For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2Himedia, Mumbai, IndiaM834-500GPreparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BLLaby Instruments, Ambala, IndiaHLL/2021-22/021Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser BrandTech, Essex CT, EnglandV1200Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar Himedia, Mumbai, IndiaM008-500GDifferential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, IndiaNJ478162Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India521020Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar Himedia, Mumbai, IndiaM173-500GAntimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4Himedia, Mumbai, IndiaLA019For streaking onto culture media
Nichrome straight wireHimedia, Mumbai, IndiaLA022For stab inoculation
Nulife sterile GlovesMRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, IndiaFor safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367815Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep bloodLabline Trading Co., Hyderabad, India70014Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainerBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA367954Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)Himedia, Mumbai, IndiaPW005-1X500NOLawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/ccNihal Healthcare, Solan, India2213805NB2Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kitbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France422219Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceV1204Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France533306-4 REVStand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubesbioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceTubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d’ Etoille, FranceVKC15144Automated identification and AST system
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d’ Etoille, France21341Identification of Gram negative bacilli

References

  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Palavras chave Sepse Gram negativaHemocultura AutomatizadaEUCAST RASTIdentifica o MicrobianaIdentifica o Microbiana Automatizada e Sistema de Teste de Suscetibilidade AntimicrobianaProtocolo de In culo DiretoProtocolo de Prepara o de In culo Padr oEscherichia ColiKlebsiella PneumoniaePseudomonas AeruginosaComplexo Acinetobacter BaumanniiConfigura es com recursos limitadosTempo de resposta

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved