Identificação microbiana direta usando um sistema automatizado de identificação microbiana para facilitar o método EUCAST RAST sem espectrometria de massa

Summary

A EUCAST desenvolveu um protocolo direto de teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) para hemoculturas automatizadas. No entanto, sua dependência da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa pode ser evitada usando um protocolo de preparação direta de inóculo em um sistema automatizado de identificação microbiana. Essa abordagem pode fornecer relatórios de AST dentro de 24 horas após a coleta da amostra.

Abstract

A sepse Gram-negativa (GN) é uma emergência médica em que o manejo em ambientes com recursos limitados depende de técnicas convencionais de cultura microbiológica que fornecem resultados em 3-4 dias. Reconhecendo esse atraso no tempo de resposta (TAT), tanto o EUCAST quanto o CLSI desenvolveram protocolos para determinar os resultados da AST diretamente de frascos de hemocultura automatizados sinalizados positivamente (+aBCs). O protocolo EUCAST rapid AST (RAST) foi introduzido pela primeira vez em 2018, onde podem ser relatados pontos de interrupção do diâmetro da zona para quatro agentes etiológicos comuns da sepse GN, ou seja, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complexo Acinetobacter baumannii . No entanto, os laboratórios clínicos que implementaram esse método em seu fluxo de trabalho de rotina dependem da identificação microbiana baseada em espectrometria de massa, que não está facilmente disponível, impedindo assim sua implementação em ambientes com recursos limitados. Para contorná-lo, avaliamos um protocolo de inóculo direto (DIP) usando um sistema comercial automatizado de identificação microbiana e teste de suscetibilidade antimicrobiana (aMIAST) para permitir a identificação microbiana precoce dentro de 8 h após a sinalização positiva de aBC. Avaliamos este protocolo de janeiro a outubro de 2023 para identificar os quatro GN relatáveis RAST (RR-GN) no aBC sinalizado positivamente. Os resultados da identificação microbiana na DIP foram comparados com o protocolo de preparação de inóculo padrão (SIP) em aMIAST. De 204 +aBCs com GN monomórfico (+naBC), um dos 4 RR-GN foi identificado em 105 +naBCs por SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complexo A. baumannii : 26). Destes, 94% (98/105) foram corretamente identificados pelo DIP, enquanto as taxas de erro maior e muito maior foram de 6% (7/105) e 1,7% (4/240), respectivamente. Quando a DIP para identificação microbiana é feita usando o método EUCAST RAST, relatórios clínicos provisórios podem ser fornecidos dentro de 24 horas após o recebimento da amostra. Essa abordagem tem o potencial de reduzir significativamente o TAT, permitindo a instituição precoce de terapia antimicrobiana apropriada.

Introduction

A sepse, um importante problema de saúde global, é definida como disfunção orgânica com risco de vida devido a uma resposta desregulada do hospedeiro à infecção. O Global Burden of Diseases Study estimou que houve 48,9 milhões de casos de sepse e 11 milhões de mortes relacionadas à sepse em todo o mundo em 2017, o que representou quase 20% de todas as mortes globais¹. Cerca^{de 2} /3 das infecções da corrente sanguínea (ICS) que causam mortalidade são devidas a patógenos bacterianos gram-negativos². As principais causas de mortalidade entre gram-negativos (GN) são Escherichia coli, Klebsiella pneumon....

Protocol

O estudo, financiado pela bolsa de pesquisa interna concedida ao Dr. Ayush Gupta pelo AIIMS Bhopal, foi aprovado pelo Comitê de Ética Humana Institucional (IHEC) vide carta nº: IHEC- LOP/2022/IL072.

NOTA: Um volume amostral de 5 ml foi utilizado com base nos estudos realizados por Quesada et ^al.25 e Munoz-Davila et ^al.27.

1. Protocolo de inóculo padrão (SIP) para identificação bacteriana usando aMIAST

Discussion

Usando o DIP, identificamos com sucesso os RR-GNs com considerável precisão diagnóstica. O TTI médio após sinalização positiva de aBC foi de apenas 507 min (~ 8,5 h). Assim, quando feito em conjunto com o método EUCAST RAST para determinação de AST, ele pode fornecer identificação isolada em 8 h de tempo de leitura de AST. Esta abordagem tem o potencial de implementar o método EUCAST RAST, evitando a necessidade de identificação baseada em espectrometria de massa. Isso é uma bênção para os ambientes de.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli