Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule

Summary

Questo protocollo descrive il metodo dell'emulsione invertita utilizzato per incapsulare un sistema di espressione libera da cellule (CFE) all'interno di una vescicola unilamellare gigante (GUV) per lo studio della sintesi e dell'incorporazione di una proteina modello di membrana nel doppio strato lipidico.

Abstract

I sistemi di espressione libera cellulare (CFE) sono potenti strumenti nella biologia sintetica che consentono la biomimetica di funzioni cellulari come il biorilevamento e la rigenerazione di energia nelle cellule sintetiche. La ricostruzione di un'ampia gamma di processi cellulari, tuttavia, richiede la ricostituzione di successo delle proteine di membrana nella membrana delle cellule sintetiche. Mentre l'espressione di proteine solubili è solitamente efficace nei comuni sistemi CFE, la ricostituzione delle proteine di membrana nei doppi strati lipidici delle cellule sintetiche si è dimostrata impegnativa. Qui, viene dimostrato un metodo per la ricostituzione di una proteina modello di membrana, il recettore batterico del glutammato (GluR0), in vescicole unilamellari giganti (GUV) come cellule sintetiche modello basate sull'incapsulamento e l'incubazione della reazione CFE all'interno di cellule sintetiche. Utilizzando questa piattaforma, è stato dimostrato l'effetto della sostituzione del peptide segnale N-terminale di GluR0 con il peptide segnale della proteorhodopsina sulla traslocazione cotraduzionale di GluR0 nelle membrane di GUV ibridi. Questo metodo fornisce una procedura robusta che consentirà la ricostituzione senza cellule di varie proteine di membrana in cellule sintetiche.

Introduction

La biologia sintetica dal basso verso l'alto ha guadagnato un crescente interesse nell'ultimo decennio come campo emergente con numerose potenziali applicazioni nella bioingegneria, nella somministrazione di farmaci e nella medicina rigenerativa ^1,2. Lo sviluppo di cellule sintetiche come pietra miliare della biologia sintetica bottom-up, in particolare, ha attratto un'ampia gamma di comunità scientifiche grazie alle promettenti applicazioni delle cellule sintetiche e alle loro proprietà fisiche e biochimiche simili a quelle cellulari che facilitano gli studi biofisici in vitro

Protocol

I reagenti e le attrezzature utilizzate per questo studio sono forniti nella Tabella dei materiali.

1. Reazioni di massa di CFE in presenza di piccole vescicole unilamellari (SUV)

1. Preparazione SUV
   NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito in una cappa aspirante seguendo le istruzioni di sicurezza per lavorare con il cloroformio.
   1. Preparare 5 mM di 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina (POPC) SUV in un flaconcino di vetro trasferendo 7.......

Discussion

Praticamente qualsiasi processo cellulare che dipende dal trasferimento di molecole o informazioni attraverso la membrana cellulare, come la segnalazione cellulare o l'eccitazione cellulare, richiede proteine di membrana. Pertanto, la ricostituzione delle proteine di membrana è diventata il principale collo di bottiglia nella realizzazione di vari progetti di cellule sintetiche per diverse applicazioni. La tradizionale ricostituzione mediata da detergenti delle proteine di membrana nelle membrane biologiche richiede met.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600