Восстановление канала бактериального глутаматного рецептора путем инкапсуляции бесклеточной экспрессионной системы

Summary

Этот протокол описывает метод инвертированной эмульсии, используемый для инкапсуляции системы бесклеточной экспрессии (CFE) в гигантскую униламеллярную везикулу (GUV) для исследования синтеза и включения модельного мембранного белка в липидный бислой.

Abstract

Системы бесклеточной экспрессии (CFE) являются мощными инструментами в синтетической биологии, которые позволяют осуществлять биомимикрию клеточных функций, таких как биосенсорика и регенерация энергии в синтетических клетках. Однако для реконструкции широкого спектра клеточных процессов требуется успешное восстановление мембранных белков в мембране синтетических клеток. В то время как экспрессия растворимых белков обычно успешна в обычных системах CFE, восстановление мембранных белков в липидных бислоях синтетических клеток оказалось сложной задачей. Здесь продемонстрирован метод воссоздания модельного мембранного белка, бактериального глутаматного рецептора (GluR0), в гигантских униламеллярных везикулах (GUVs) в модельных синтетических клетках, основанный на инкапсуляции и инкубации реакции CFE внутри синтетических клеток. С помощью этой платформы продемонстрировано влияние замещения N-концевого сигнального пептида GluR0 на сигнальный пептид протеородопсина на успешную котрансляционную транслокацию GluR0 в мембраны гибридных GUVs. Этот метод обеспечивает надежную процедуру, которая позволит бесклеточному восстановлению различных мембранных белков в синтетических клетках.

Introduction

В последнее десятилетие синтетическая биология «снизу вверх» вызывает все больший интерес как новая область с многочисленными потенциальными применениями в биоинженерии, доставке лекарств и регенеративной медицине ^1,2. Развитие синтетических клеток как краеугольного камня синтетической биологии «снизу вверх», в частности, привлекло широкий круг научных сообществ благодаря многообещающему применению синтетических клеток, а также их клеточным физическим и биохимическим свойствам, которые облегчают биофизические исследования in vitro 3,4,5,6

Protocol

Реагенты и оборудование, использованные для этого исследования, приведены в Таблице материалов.

1. Объемные реакции CFE в присутствии мелких униламеллярных везикул (SUV)

1. Подготовка внедорожника
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходимо выполнять в вытяжном.......

Discussion

Практически любой клеточный процесс, который зависит от передачи молекул или информации через клеточную мембрану, такой как клеточная сигнализация или клеточное возбуждение, требует мембранных белков. Таким образом, восстановление мембранных белков стало основным узким местом в реа?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 nm polycarbonate filter	STERLITECH	1270193
96 Well Clear Bottom Plate	ThermoFisher Scientific	165305
BioTek Synergy H1M Hybrid Multi-Mode Reader	Agilent	11-120-533
Creatine phosphate	Millipore Sigma	10621714001
CSU-X1 Confocal Scanner Unit	Yokogawa	CSU-X1
Density gradient medium (Optiprep)	Millipore Sigma	D1556	Optional to switch with sucrose in inner solution
Filter supports	Avanti	610014
Fisherbrand microtubes (1.5 mL)	Fisher Scientific	05-408-129
Folinic acid calcium salt hydrate	Millipore Sigma	F7878
Glucose	Millipore Sigma	158968
HEPES	Millipore Sigma	H3375
iXon X3 camera	Andor	DU-897E-CS0
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	Millipore Sigma	G1501
Light mineral oil	Millipore Sigma	M5904
Magnesium acetate tetrahydrate	Millipore Sigma	M5661
Mini-extruder kit (including syringe holder and extruder stand)	Avanti	610020
Olympus IX81 Inverted Microscope	Olympus	IX21
Olympus PlanApo N 60x Oil Microscope Objective	Olympus	1-U2B933
PEO-b-PBD	Polymer Source	P41745-BdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) plasmid DNA	Homemade	N/A
pET28b-WT-GluR0-sfGFP plasmid DNA	Homemade	N/A
POPC lipid in chloroform	Avanti	850457C
Potassium chloride	Millipore Sigma	P9541
PUREfrex 2.0	Cosmo Bio USA	GFK-PF201
Ribonucleotide Solution Set	New England BioLabs	N0450
RNase Inhibitor, Murine	New England BioLabs	M0314S
RTS Amino Acid Sampler	Biotechrabbit	BR1401801
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888
Spermidine	Millipore Sigma	S2626
Sucrose	Millipore Sigma	S0389
VAPRO Vapor Pressure Osmometer Model 5600	ELITechGroup	VAPRO 5600