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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

I modelli Lung-on-chip superano le tradizionali colture 2D imitando l'interfaccia aria-liquido e la perfusione delle cellule endoteliali, simulando il flusso sanguigno e lo scambio di nutrienti cruciali per gli studi di fisiologia polmonare. Ciò migliora la rilevanza della ricerca polmonare, offrendo un ambiente dinamico e fisiologicamente accurato per far progredire la comprensione e il trattamento delle infezioni respiratorie.

Abstract

Introduciamo un modello avanzato immunocompetente lung-on-chip progettato per replicare la struttura e la funzione alveolare umana. Questo modello innovativo impiega un biochip microfluidico-perfuso che supporta un'interfaccia aria-liquido che imita l'ambiente negli alveoli umani. L'ingegneria tissutale viene utilizzata per integrare componenti cellulari chiave, tra cui cellule endoteliali, macrofagi e cellule epiteliali, per creare un modello tissutale rappresentativo dell'alveolo. Il modello facilita esami approfonditi delle risposte immunitarie della mucosa a vari agenti patogeni, tra cui virus, batteri e funghi, migliorando così la nostra comprensione dell'immunità polmonare. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire dettagli per stabilire questo modello di alveolo su chip come una solida piattaforma in vitro per studi sulle infezioni, consentendo ai ricercatori di osservare e analizzare da vicino le complesse interazioni tra i patogeni e il sistema immunitario dell'ospite all'interno dell'ambiente polmonare. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di tecniche basate sulla microfluidica per simulare le condizioni fisiologiche chiave degli alveoli umani, tra cui il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali, oltre a mantenere un'interfaccia aria-liquido cruciale per l'esposizione realistica delle cellule epiteliali all'aria. Il sistema modello è compatibile con una serie di test standardizzati, come la colorazione in immunofluorescenza, la profilazione delle citochine e l'analisi delle unità formanti colonie (CFU)/placche, consentendo una visione completa delle dinamiche immunitarie durante l'infezione. L'Alveolus-on-chip è composto da tipi di cellule essenziali, tra cui le cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati strategicamente tra gli strati epiteliale ed endoteliale. Il modello tissutale migliora la capacità di sezionare e analizzare i fattori sfumati coinvolti nelle risposte immunitarie polmonari in vitro. Come strumento prezioso, dovrebbe contribuire al progresso della ricerca polmonare, fornendo un modello in vitro più accurato e dinamico per studiare la patogenesi delle infezioni respiratorie e testare potenziali interventi terapeutici.

Introduction

Il polmone umano ha un ruolo notevole nella respirazione e nella difesa immunitaria, con complesse interazioni tra le risposte immunitarie della mucosa alveolare1. La capacità degli alveoli di creare una risposta immunitaria efficiente è fondamentale per prevenire le infezioni polmonari e garantire la salute polmonare. Poiché i polmoni sono costantemente esposti a un'ampia gamma di potenziali rischi, tra cui batteri, virus, funghi, allergie e particolato, comprendere la complessità delle risposte immunitarie della mucosa alveolare è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle infezioni respiratorie, dei disturbi infiammatori e del tr....

Protocol

Le cellule HUVEC sono isolate dal cordone ombelicale e utilizzate fino al passaggio 4. I monociti primari sono isolati da donatori sani da sangue intero. Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale universitario di Jena, Jena, Germania (3939-12/13). Secondo la Dichiarazione di Helsinki, tutti gli individui che hanno donato cellule per lo studio hanno dato il loro consenso informato.

1. Giorno 1: Preparazione del biochip

  1. I biochip sono disponibili in.......

Representative Results

Un esame delle alterazioni morfologiche e dell'espressione di proteine marcatrici potrebbe essere eseguito utilizzando la colorazione in immunofluorescenza. Dopo la co-coltura per 14 giorni, i lati vascolare ed epiteliale vengono analizzati per l'espressione dei rispettivi marcatori cellulari. Questo metodo è utile per studiare le interazioni e l'integrità delle componenti vascolari ed epiteliali, che è essenziale per la modellazione della malattia come lettura biologica funzionale correlata all'infezione. La colorazi.......

Discussion

Il modello alveolo-on-chip rappresenta un modello tissutale multistrato dell'alveolo umano, che integra tipi cellulari essenziali del tratto respiratorio inferiore, comprese le cellule epiteliali polmonari, le cellule endoteliali e i macrofagi, coltivate in una disposizione organotipica in un ALI con media perfusione del rivestimento endoteliale. Cellule di diversi strati esprimono specifiche proteine marcatrici cellulari come la E-caderina, una molecola di adesione calcio-dipendente delle cellule epiteliali polmonari, c.......

Disclosures

K.R. è CEO di Dynamic42 GmbH e detiene il capitale della società. A.S.M. è consulente scientifico di Dynamic 42 GmbH e detiene il capitale della società. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgements

H.K. e A.S.M. riconoscono il finanziamento del Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, finanziato dalla linea di finanziamento Strategic Networking dell'Associazione Leibniz. M.A. e A.S.M. sono stati sostenuti dal progetto IGF IMPROVE finanziato dal Ministero Federale per gli Affari Economici e l'Energia sulla base di una risoluzione del Bundestag tedesco. A.S.M riconosce inoltre il sostegno finanziario del Cluster of Excellence Balance of the Microverse nell'ambito della Strategia di Eccellenza della Germania - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)InvitrogenC10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, sterilGreiner Bio-One662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, sterilGreiner Bio-One657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)Menzel-Gläser15747592
Eco wipesDr. Schuhmacher00-915-REW10003-01
Eppies 2.0Sarstedt72.691
Eppis 0.5Sarstedt72.699
Eppis 1.5Sarstedt72.690.001
Falcons 15mLGreiner Bio-One188 271-TRI
Falcons 50mLGreiner Bio-One227 261-TRI
Gauze swabNobaPZN 2417767
Gloves Nitril 3000Meditrade1280
Microscope slidesMenzel-GläserAAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterileGreiner Bio-One662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mmAssistent40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mmAssistent40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)Falcon352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mmSarstedt85.1637.235
ScalpelsDahlhausen11.000.00.715
Serological pipettes 10mLGreiner Bio-One607 160-TRI
Serological pipettes 25mLGreiner Bio-One760 160-TRI
Serological pipettes 2mLGreiner Bio-One710 160-TRI
Serological pipettes 50mLGreiner Bio-One768 160-TRI
Serological pipettes 5mLGreiner Bio-One606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-GelSarstedt1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3ESarstedt02.1066.001
Softasept NBraun3887138
T25 flaskGreiner Bio-One690 960
Tips sterile 10µLGreiner Bio-One771 261
Tips sterile 1250µLGreiner Bio-One750 261
Tips sterile 300µLGreiner Bio-One738 261
Tips unsterile 10µLGreiner Bio-One765 290
Tips unsterile 1000µLGreiner Bio-One739 291
Tips unsterile 200µLGreiner Bio-One686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)RothK343.1
Chemicals
Descosept AFDr. SchuhmacherN-20338
Ethanol 96%Nordbrand-Nordhausen410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)Sigma AldrichFD4-100MG
Fluorescent Mounting MediumDakoS3023
MethanolVWR20847.295
SaponinFluka47036
TergazymeAlconox1304-1
Cell culture
Collagen IVSigma-AldrichC5533-5MG
DexametasonSigma-AldrichD4902
DPBS (-/-)LonzaBE17-516F
DPBS (+/+)LonzaBE17-513F
EDTA solutionSigma-AldrichE788S
Endothelial Cell Growth MediumPromocellC-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mixPromocellC-39225
Fetal bovine SerumSigma-AldrichE2129-10g
H441ATCC
Human recombinant GM-CSFPeprotech300-30
LidocainSigma-AldrichL5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140-122 /-163
RPMIGibco72400047
Trypane blue stain 0.4%InvitrogenT10282
TrypsinGibco15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)BD610252
CD68 (rabbit)CellSignaling76437
E-Cadherin (goat)R&DAF748
SP-A (mouse)Abcamab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)InvitrogenR37114
AF647 (donkey anti mouse)invitrogenA31571
AF647 (donkey anti rabbit)InvitrogenA31573
Cy3 (donkey anti goat)jackson research705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)InvitrogenD3571
Microfluidic
ChipDynamic 42BC002
Male Luer Lock (small)ChipShop09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, greenMicrofluidic chipshop09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaqueMicrofluidic chipshop09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, redMicrofluidic chipshop09-0557-0336-10
PlugsCole ParmerGZ-45555-56
Reservoir 4.5mLChipShop16-0613-0233-09
TubingDynamic 42ST001
Equipment
AutoclaveTuttnauer5075 ELV
CentrifugeEppendorf5424
CO2 IncubatorHeracell150i
Countess automated cell counterInvitrogenC10227
FlowcytometerBDFACS Canto II
Freezer (-20 °C)LiebherrLCexv 4010
Freezer (-80 °C)HeraeusHerafreeze HFU 686
FridgeLiebherrLCexv 4010
Heraeus MultifugeThermo ScientificX3R
MicroscopeLeicaDM IL LED
Orbital shakerHeidolphReax2000
Peristaltic pumpREGLO Digital MS-4/12ISM597D
Pipettes 10µLEppendorf Research plus3123000020
Pipettes 100µLEppendorf Research plus3123000047
Pipettes 1000µLEppendorf Research plus3123000063
Pipettes 2.5µLEppendorf Research plus3123000012
Pipettes 20µLEppendorf Research plus3123000039
Pipettes 200µLEppendorf Research plus3123000055
ScaleSartorius6101
ScaleSartoriusTE1245
Sterile benchKojairBiowizard SL-130
WaterbathJulaboSW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2Zeiss
Illumination deviceZeissHXP 120 C
MicroscopeZeissAxio Observer 5
Optical SectioningZeissApoTome
Power Supply MicroscopeZeissEplax Vp232
Software
ZEN Blue EditionZeiss

References

  1. Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
  2. Artzy-Schnirman, A., et al.

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Parole chiavi Alveolus on chipImmunocompetenteLung on chipRisposte immunitarie della mucosa alveolareMicrofluidicoInterfaccia aria liquidoIngegneria tissutaleCellule endotelialiMacrofagiCellule epitelialiPatogeniImmunit polmonareModello di infezione in vitroCondizioni fisiologicheProfilazione delle citochineAnalisi dell unit formante colonieCellule H441HUVECMacrofagi primari derivati da monocitiInfezioni respiratorieInterventi terapeutici

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