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I modelli Lung-on-chip superano le tradizionali colture 2D imitando l'interfaccia aria-liquido e la perfusione delle cellule endoteliali, simulando il flusso sanguigno e lo scambio di nutrienti cruciali per gli studi di fisiologia polmonare. Ciò migliora la rilevanza della ricerca polmonare, offrendo un ambiente dinamico e fisiologicamente accurato per far progredire la comprensione e il trattamento delle infezioni respiratorie.
Introduciamo un modello avanzato immunocompetente lung-on-chip progettato per replicare la struttura e la funzione alveolare umana. Questo modello innovativo impiega un biochip microfluidico-perfuso che supporta un'interfaccia aria-liquido che imita l'ambiente negli alveoli umani. L'ingegneria tissutale viene utilizzata per integrare componenti cellulari chiave, tra cui cellule endoteliali, macrofagi e cellule epiteliali, per creare un modello tissutale rappresentativo dell'alveolo. Il modello facilita esami approfonditi delle risposte immunitarie della mucosa a vari agenti patogeni, tra cui virus, batteri e funghi, migliorando così la nostra comprensione dell'immunità polmonare. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire dettagli per stabilire questo modello di alveolo su chip come una solida piattaforma in vitro per studi sulle infezioni, consentendo ai ricercatori di osservare e analizzare da vicino le complesse interazioni tra i patogeni e il sistema immunitario dell'ospite all'interno dell'ambiente polmonare. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di tecniche basate sulla microfluidica per simulare le condizioni fisiologiche chiave degli alveoli umani, tra cui il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali, oltre a mantenere un'interfaccia aria-liquido cruciale per l'esposizione realistica delle cellule epiteliali all'aria. Il sistema modello è compatibile con una serie di test standardizzati, come la colorazione in immunofluorescenza, la profilazione delle citochine e l'analisi delle unità formanti colonie (CFU)/placche, consentendo una visione completa delle dinamiche immunitarie durante l'infezione. L'Alveolus-on-chip è composto da tipi di cellule essenziali, tra cui le cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati strategicamente tra gli strati epiteliale ed endoteliale. Il modello tissutale migliora la capacità di sezionare e analizzare i fattori sfumati coinvolti nelle risposte immunitarie polmonari in vitro. Come strumento prezioso, dovrebbe contribuire al progresso della ricerca polmonare, fornendo un modello in vitro più accurato e dinamico per studiare la patogenesi delle infezioni respiratorie e testare potenziali interventi terapeutici.
Il polmone umano ha un ruolo notevole nella respirazione e nella difesa immunitaria, con complesse interazioni tra le risposte immunitarie della mucosa alveolare1. La capacità degli alveoli di creare una risposta immunitaria efficiente è fondamentale per prevenire le infezioni polmonari e garantire la salute polmonare. Poiché i polmoni sono costantemente esposti a un'ampia gamma di potenziali rischi, tra cui batteri, virus, funghi, allergie e particolato, comprendere la complessità delle risposte immunitarie della mucosa alveolare è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle infezioni respiratorie, dei disturbi infiammatori e del tr....
Le cellule HUVEC sono isolate dal cordone ombelicale e utilizzate fino al passaggio 4. I monociti primari sono isolati da donatori sani da sangue intero. Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale universitario di Jena, Jena, Germania (3939-12/13). Secondo la Dichiarazione di Helsinki, tutti gli individui che hanno donato cellule per lo studio hanno dato il loro consenso informato.
1. Giorno 1: Preparazione del biochip
Un esame delle alterazioni morfologiche e dell'espressione di proteine marcatrici potrebbe essere eseguito utilizzando la colorazione in immunofluorescenza. Dopo la co-coltura per 14 giorni, i lati vascolare ed epiteliale vengono analizzati per l'espressione dei rispettivi marcatori cellulari. Questo metodo è utile per studiare le interazioni e l'integrità delle componenti vascolari ed epiteliali, che è essenziale per la modellazione della malattia come lettura biologica funzionale correlata all'infezione. La colorazi.......
Il modello alveolo-on-chip rappresenta un modello tissutale multistrato dell'alveolo umano, che integra tipi cellulari essenziali del tratto respiratorio inferiore, comprese le cellule epiteliali polmonari, le cellule endoteliali e i macrofagi, coltivate in una disposizione organotipica in un ALI con media perfusione del rivestimento endoteliale. Cellule di diversi strati esprimono specifiche proteine marcatrici cellulari come la E-caderina, una molecola di adesione calcio-dipendente delle cellule epiteliali polmonari, c.......
H.K. e A.S.M. riconoscono il finanziamento del Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, finanziato dalla linea di finanziamento Strategic Networking dell'Associazione Leibniz. M.A. e A.S.M. sono stati sostenuti dal progetto IGF IMPROVE finanziato dal Ministero Federale per gli Affari Economici e l'Energia sulla base di una risoluzione del Bundestag tedesco. A.S.M riconosce inoltre il sostegno finanziario del Cluster of Excellence Balance of the Microverse nell'ambito della Strategia di Eccellenza della Germania - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Consumables | |||
Cellcounting chamber slides (Countess) | Invitrogen | C10283 | |
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril | Greiner Bio-One | 662 160 | |
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril | Greiner Bio-One | 657 160 | |
Coverslips (24x40mm; #1.5) | Menzel-Gläser | 15747592 | |
Eco wipes | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
Gauze swab | Noba | PZN 2417767 | |
Gloves Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
Microscope slides | Menzel-Gläser | AAAA000001##12E | |
Multiwell Plates 24 Well, sterile | Greiner Bio-One | 662 160 | |
Pasteur pipettes (glass) 150mm | Assistent | 40567001 | |
Pasteur pipettes (glass) 230mm | Assistent | 40567002 | |
Round-bottom tubes (PS, 5mL) | Falcon | 352052 | |
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm | Sarstedt | 85.1637.235 | |
Scalpels | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
Serological pipettes 10mL | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
Serological pipettes 25mL | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
Serological pipettes 2mL | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
Serological pipettes 50mL | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
Serological pipettes 5mL | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel | Sarstedt | 1.1602 | |
S-Monovette, 9,0ml K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
Softasept N | Braun | 3887138 | |
T25 flask | Greiner Bio-One | 690 960 | |
Tips sterile 10µL | Greiner Bio-One | 771 261 | |
Tips sterile 1250µL | Greiner Bio-One | 750 261 | |
Tips sterile 300µL | Greiner Bio-One | 738 261 | |
Tips unsterile 10µL | Greiner Bio-One | 765 290 | |
Tips unsterile 1000µL | Greiner Bio-One | 739 291 | |
Tips unsterile 200µL | Greiner Bio-One | 686 290 | |
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm) | Roth | K343.1 | |
Chemicals | |||
Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
Ethanol 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
Fluorescent Mounting Medium | Dako | S3023 | |
Methanol | VWR | 20847.295 | |
Saponin | Fluka | 47036 | |
Tergazyme | Alconox | 1304-1 | |
Cell culture | |||
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
EDTA solution | Sigma-Aldrich | E788S | |
Endothelial Cell Growth Medium | Promocell | C-22020 | |
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix | Promocell | C-39225 | |
Fetal bovine Serum | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
H441 | ATCC | ||
Human recombinant GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
Lidocain | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
RPMI | Gibco | 72400047 | |
Trypane blue stain 0.4% | Invitrogen | T10282 | |
Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
Primary antibodies | |||
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat) | BD | 610252 | |
CD68 (rabbit) | CellSignaling | 76437 | |
E-Cadherin (goat) | R&D | AF748 | |
SP-A (mouse) | Abcam | ab51891 | |
Secondary antibodies | |||
AF488 (donkey anti mouse) | Invitrogen | R37114 | |
AF647 (donkey anti mouse) | invitrogen | A31571 | |
AF647 (donkey anti rabbit) | Invitrogen | A31573 | |
Cy3 (donkey anti goat) | jackson research | 705-165-147 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | Invitrogen | D3571 | |
Microfluidic | |||
Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
Male Luer Lock (small) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, green | Microfluidic chipshop | 09-0558-0336-11 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque | Microfluidic chipshop | 09-0556-0336-09 | |
Male mini luer plugs, row of four,PP, red | Microfluidic chipshop | 09-0557-0336-10 | |
Plugs | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
Reservoir 4.5mL | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
Tubing | Dynamic 42 | ST001 | |
Equipment | |||
Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
CO2 Incubator | Heracell | 150i | |
Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | |
Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
Freezer (-20 °C) | Liebherr | LCexv 4010 | |
Freezer (-80 °C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
Fridge | Liebherr | LCexv 4010 | |
Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
Microscope | Leica | DM IL LED | |
Orbital shaker | Heidolph | Reax2000 | |
Peristaltic pump | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
Pipettes 10µL | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
Pipettes 100µL | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
Pipettes 1000µL | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
Pipettes 2.5µL | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
Pipettes 20µL | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
Pipettes 200µL | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
Scale | Sartorius | 6101 | |
Scale | Sartorius | TE1245 | |
Sterile bench | Kojair | Biowizard SL-130 | |
Waterbath | Julabo | SW-20C | |
Fluorescence Microscope Setup | |||
Apotome.2 | Zeiss | ||
Illumination device | Zeiss | HXP 120 C | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer 5 | |
Optical Sectioning | Zeiss | ApoTome | |
Power Supply Microscope | Zeiss | Eplax Vp232 | |
Software | |||
ZEN Blue Edition | Zeiss |
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