Modello immunocompetente di alveoli su chip per lo studio delle risposte immunitarie della mucosa alveolare

Summary

I modelli Lung-on-chip superano le tradizionali colture 2D imitando l'interfaccia aria-liquido e la perfusione delle cellule endoteliali, simulando il flusso sanguigno e lo scambio di nutrienti cruciali per gli studi di fisiologia polmonare. Ciò migliora la rilevanza della ricerca polmonare, offrendo un ambiente dinamico e fisiologicamente accurato per far progredire la comprensione e il trattamento delle infezioni respiratorie.

Abstract

Introduciamo un modello avanzato immunocompetente lung-on-chip progettato per replicare la struttura e la funzione alveolare umana. Questo modello innovativo impiega un biochip microfluidico-perfuso che supporta un'interfaccia aria-liquido che imita l'ambiente negli alveoli umani. L'ingegneria tissutale viene utilizzata per integrare componenti cellulari chiave, tra cui cellule endoteliali, macrofagi e cellule epiteliali, per creare un modello tissutale rappresentativo dell'alveolo. Il modello facilita esami approfonditi delle risposte immunitarie della mucosa a vari agenti patogeni, tra cui virus, batteri e funghi, migliorando così la nostra comprensione dell'immunità polmonare. L'obiettivo principale di questo protocollo è fornire dettagli per stabilire questo modello di alveolo su chip come una solida piattaforma in vitro per studi sulle infezioni, consentendo ai ricercatori di osservare e analizzare da vicino le complesse interazioni tra i patogeni e il sistema immunitario dell'ospite all'interno dell'ambiente polmonare. Ciò si ottiene attraverso l'applicazione di tecniche basate sulla microfluidica per simulare le condizioni fisiologiche chiave degli alveoli umani, tra cui il flusso sanguigno e la stimolazione biomeccanica delle cellule endoteliali, oltre a mantenere un'interfaccia aria-liquido cruciale per l'esposizione realistica delle cellule epiteliali all'aria. Il sistema modello è compatibile con una serie di test standardizzati, come la colorazione in immunofluorescenza, la profilazione delle citochine e l'analisi delle unità formanti colonie (CFU)/placche, consentendo una visione completa delle dinamiche immunitarie durante l'infezione. L'Alveolus-on-chip è composto da tipi di cellule essenziali, tra cui le cellule epiteliali polmonari distali umane (H441) e le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) separate da membrane porose in polietilene tereftalato (PET), con macrofagi primari derivati da monociti posizionati strategicamente tra gli strati epiteliale ed endoteliale. Il modello tissutale migliora la capacità di sezionare e analizzare i fattori sfumati coinvolti nelle risposte immunitarie polmonari in vitro. Come strumento prezioso, dovrebbe contribuire al progresso della ricerca polmonare, fornendo un modello in vitro più accurato e dinamico per studiare la patogenesi delle infezioni respiratorie e testare potenziali interventi terapeutici.

Introduction

Il polmone umano ha un ruolo notevole nella respirazione e nella difesa immunitaria, con complesse interazioni tra le risposte immunitarie della mucosa alveolare¹. La capacità degli alveoli di creare una risposta immunitaria efficiente è fondamentale per prevenire le infezioni polmonari e garantire la salute polmonare. Poiché i polmoni sono costantemente esposti a un'ampia gamma di potenziali rischi, tra cui batteri, virus, funghi, allergie e particolato, comprendere la complessità delle risposte immunitarie della mucosa alveolare è fondamentale per scoprire i meccanismi alla base delle infezioni respiratorie, dei disturbi infiammatori e del tr....

Protocol

Le cellule HUVEC sono isolate dal cordone ombelicale e utilizzate fino al passaggio 4. I monociti primari sono isolati da donatori sani da sangue intero. Lo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale universitario di Jena, Jena, Germania (3939-12/13). Secondo la Dichiarazione di Helsinki, tutti gli individui che hanno donato cellule per lo studio hanno dato il loro consenso informato.

1. Giorno 1: Preparazione del biochip

1. I biochip sono disponibili in.......

Discussion

Il modello alveolo-on-chip rappresenta un modello tissutale multistrato dell'alveolo umano, che integra tipi cellulari essenziali del tratto respiratorio inferiore, comprese le cellule epiteliali polmonari, le cellule endoteliali e i macrofagi, coltivate in una disposizione organotipica in un ALI con media perfusione del rivestimento endoteliale. Cellule di diversi strati esprimono specifiche proteine marcatrici cellulari come la E-caderina, una molecola di adesione calcio-dipendente delle cellule epiteliali polmonari, c.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss