Иммунокомпетентная модель альвеолы на чипе для изучения иммунных реакций альвеолярной слизистой оболочки

Summary

Модели легких на чипе превосходят традиционные 2D-культуры, имитируя воздушно-жидкостную границу раздела и перфузию эндотелиальных клеток, имитируя кровоток и обмен питательных веществ, что имеет решающее значение для исследований физиологии легких. Это повышает актуальность исследований легких, предлагая динамичную, физиологически точную среду для улучшения понимания и лечения респираторных инфекций.

Abstract

Мы представляем передовую иммунокомпетентную модель легкого на чипе, предназначенную для воспроизведения альвеолярной структуры и функции человека. В этой инновационной модели используется микрофлюидно-перфузионный биочип, который поддерживает воздушно-жидкостную границу, имитирующую окружающую среду в альвеолах человека. Тканевая инженерия используется для интеграции ключевых клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, макрофаги и эпителиальные клетки, для создания репрезентативной тканевой модели альвеолы. Модель облегчает углубленное изучение иммунных реакций слизистых оболочек на различные патогены, включая вирусы, бактерии и грибки, тем самым улучшая наше понимание иммунитета легких. Основная цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить подробную информацию для создания этой модели альвеолы на чипе в качестве надежной платформы in vitro для изучения инфекций, позволяющей исследователям внимательно наблюдать и анализировать сложные взаимодействия между патогенами и иммунной системой хозяина в легочной среде. Это достигается за счет применения микрофлюидных методов для моделирования ключевых физиологических состояний альвеол человека, включая кровоток и биомеханическую стимуляцию эндотелиальных клеток, а также поддержания границы раздела воздух-жидкость, имеющего решающее значение для реалистичного воздействия воздуха на эпителиальные клетки. Модельная система совместима с рядом стандартизированных анализов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание, профилирование цитокинов и анализ колониеобразующих единиц (КОЕ)/бляшек, что позволяет получить всестороннее представление об иммунной динамике во время инфекции. Альвеола-он-чип состоит из основных типов клеток, включая эпителиальные клетки дистального отдела легких человека (H441) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs), разделенные пористыми мембранами из полиэтилентерефталата (ПЭТ), при этом первичные макрофаги, полученные из моноцитов, стратегически расположены между эпителиальным и эндотелиальным слоями. Тканевая модель расширяет возможности препарирования и анализа нюансов факторов, участвующих в легочных иммунных реакциях in vitro. Являясь ценным инструментом, он должен способствовать развитию исследований легких, обеспечивая более точную и динамичную модель in vitro для изучения патогенеза респираторных инфекций и тестирования потенциальных терапевтических вмешательств.

Introduction

Легкое человека играет замечательную роль в дыхании и иммунной защите, со сложными взаимодействиями между иммунными реакциями альвеолярной слизистой оболочки¹. Способность альвеол создавать эффективный иммунный ответ жизненно важна для предотвращения инфекций легких и обеспечения здоровья легких. Поскольку легкие постоянно подвергаются воздействию широкого спектра потенциальных рисков, включая бактерии, вирусы, грибки, аллергии и твердые частицы, понимание сложностей иммунных реакций слизистых оболочек альвеол имеет решающее значение для выявления механизмов респираторных инфекций, воспалительных заболеваний и лечения легочных^....

Protocol

Клетки HUVEC выделяют из пуповины и используют до пассажа 4. Первичные моноциты выделяются от здоровых доноров из цельной крови. Исследование было одобрено комитетом по этике Университетской больницы Йены, Йена, Германия (3939-12/13). Согласно Хельсинкской декларации, все лица, сдающие клетки ?.......

Discussion

Модель альвеолы на чипе представляет собой многослойную тканевую модель альвеолы человека, объединяющую основные типы клеток нижних дыхательных путей, включая эпителиальные клетки легких, эндотелиальные клетки и макрофаги, культивируемые в органотипической компоновке в ОПЛ со сред?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss