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Summary

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Abstract

Le microglia svolgono un ruolo fondamentale nel raffinamento sinaptico nel cervello. L'analisi dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi è essenziale per comprendere questo processo; tuttavia, i metodi attualmente disponibili per identificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi, come l'immunoistochimica (IHC) e l'imaging, sono laboriosi e richiedono molto tempo. Per affrontare questa sfida, presentiamo qui saggi in vitro e in vivo* che consentono una quantificazione rapida e ad alto rendimento dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi utilizzando la citometria a flusso.

Nell'approccio in vivo* , abbiamo eseguito la colorazione intracellulare di vGLUT1 dopo l'isolamento di cellule fresche da cervelli di topo adulto per quantificare l'inghiottimento delle sinapsi vGLUT1+ da parte della microglia. Nel saggio di inghiottimento dei sinaptosomi in vitro , abbiamo utilizzato cellule appena isolate dal cervello di topo adulto per quantificare l'inghiottimento dei sinaptosomi marcati con pHrodo Red da parte della microglia. Questi protocolli insieme forniscono un approccio efficiente in termini di tempo per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi e rappresentano alternative promettenti ai metodi basati sull'analisi delle immagini ad alta intensità di lavoro. Semplificando l'analisi, questi saggi possono contribuire a una migliore comprensione del ruolo della microglia nel raffinamento sinaptico in diversi modelli di malattia.

Introduction

Le microglia sono le cellule immunitarie residenti del sistema nervoso centrale (SNC)1. Scansionano costantemente il loro microambiente e forniscono sorveglianza 1,2. Inoltre, interagiscono frequentemente con le sinapsi e mediano una messa a punto dell'attività sinaptica3. Pertanto, sono emersi come un attore chiave nel processo di raffinamento sinaptico.

Il ruolo della microglia nell'affinamento sinaptico attraverso l'inghiottimento delle sinapsi è stato dimostrato da vari gruppi di ricerca 3,4,5,6,7. Le interruzioni di questo processo possono contribuire alla patologia dei disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativi come la schizofrenia e il morbo di Alzheimer8. L'affinamento sinaptico aberrante da parte della microglia è già stato rilevato in vari modelli murini di disturbi neurologici 5,9,10. Pertanto, l'identificazione di meccanismi distinti alla base dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi è fondamentale per comprendere la fisiopatologia dei disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativi8.

Colpire l'inghiottimento microgliale delle sinapsi ha un grande potenziale sia per intervenire nella progressione della malattia che per ottenere informazioni sui meccanismi alla base dei disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo. Per facilitare tali indagini, sono necessari approcci rapidi e ad alto rendimento. Gli attuali approcci metodologici comprendono saggi in vivo, ex vivo e in vitro che consentono la rilevazione di materiale sinaptico all'interno della microglia. In generale, il rilevamento dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi si basa fortemente sull'immunoistochimica (IHC) e sugli approcci basati sulla microscopia 5,6,11, che sono laboriosi e mostrano limitazioni nell'analisi di un gran numero di microglia.

Date queste limitazioni tecniche, l'esplorazione di metodologie alternative è imperativa. Per ovviare a questo problema, abbiamo ottimizzato un approccio basato sulla citometria a flusso, che consente un'analisi efficiente, imparziale e ad alto rendimento dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi. Abbiamo scelto l'ippocampo come principale regione di interesse per il suo alto grado di rimodellamento sinaptico e plasticità12, ma il protocollo può essere adattato a varie regioni del cervello. Sebbene la citometria a flusso sia già stata utilizzata in studi precedenti per rilevare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi 13,14,15, qui forniamo una metodologia passo-passo che impiega un anticorpo vGLUT1 coniugato con fluorofori attualmente disponibile in commercio. Inoltre, forniamo un approccio complementare in vitro per lo screening ad alto rendimento dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico utilizzando sinaptosomi grezzi.

Protocol

Una visione generale della procedura sperimentale è illustrata graficamente nella Figura 1A. Tutti gli esperimenti che prevedono la manipolazione di animali vivi sono stati eseguiti in stretta conformità con la legge tedesca sulla protezione degli animali e sono stati approvati dall'Ufficio regionale per la salute e i servizi sociali di Berlino (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania). I topi sono stati alloggiati in gruppi in gabbie ventilate in condizioni di laboratorio standard con un ciclo luce/buio di 12:12 ore presso la struttura del centro animale del Max Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC). Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Vedere la Tabella 1 per la composizione di tamponi e reagenti e la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti, gli strumenti e i materiali utilizzati in questo protocollo. Per il test specifico per vGLUT1, abbiamo utilizzato il termine in vivo* in tutto il manoscritto per riconoscere che la citometria a flusso richiede l'omogeneizzazione dei tessuti e l'isolamento cellulare e che le microglia mostrano circa il 95% di vitalità dopo la procedura di isolamento (Figura 1B e Figura S1 supplementare). Pertanto, mantengono la loro capacità di inghiottire il materiale sinaptico ex vivo, per un breve periodo, fino alla fissazione. Pertanto, la quantificazione della microglia vGLUT1+ comprende sia l'inghiottimento in vivo che quello ex vivo a breve termine fino alla fase di fissazione.

1. Colorazione intracellulare vGLUT1 per la rilevazione dell'inghiottimento in vivo* delle sinapsi glutammatergiche da parte della microglia

NOTA: La seguente procedura di isolamento cellulare è adattata da16. Tutte le fasi dell'isolamento cellulare devono essere eseguite su ghiaccio.

  1. Anestetizzare i topi utilizzando l'iniezione intraperitoneale di pentobarbital. Perfondere i topi per via intracardica con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) ghiacciata per ~2 minuti.
    NOTA: Viene utilizzato un mouse per campione (n).
  2. Estrarre il cervello dal cranio e conservarlo in 1 ml di terreno di cellule neurali.
    NOTA: Il mezzo cellulare neurale, come il terreno Hibernate-A, viene utilizzato per garantire un'elevata vitalità delle cellule dopo il processo di dissociazione tissutale.
  3. Trasferire il cervello in una capsula di Petri riempita con 1 ml di terreno cellulare neurale ghiacciato e sezionare l'ippocampo come descritto in precedenza17.
  4. Trasferire l'ippocampo in un omogeneizzatore Dounce riempito con 1 mL di terreno di cellule neurali e dissociare il tessuto usando il pestello sciolto con circa ~25 colpi delicati.
  5. Posizionare un colino da 70 μm su una provetta in polipropilene da 5 mL e aggiungere 500 μL di terreno di cellule neurali. Trasferire l'omogeneizzato di tessuto nella provetta in polipropilene da 5 mL attraverso il colino.
  6. Sciacquare l'omogeneizzatore Dounce 2 volte con 1 mL di terreno di coltura neurale fredda e centrifugare i campioni a 400 × g per 8 minuti.
  7. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 μl di DPBS ghiacciato mediante pipettaggio delicato. Garantire una sospensione omogenea e completare il volume finale a 1,5 mL utilizzando DPBS.
  8. Aggiungere 500 μL di soluzione isotonica di Percoll al campione, risospenderla delicatamente e sovrapporla con altri 2 ml di DPBS freddo.
  9. Centrifugare i campioni a 3.000 × g per 10 minuti con la massima accelerazione e senza freni. Aspirare lo strato superiore e il disco mielinico nella fase intermedia.
    NOTA: Tutte le seguenti fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 oC se non diversamente specificato.
  10. Aggiungere 4 mL di DPBS freddo e centrifugare i campioni a 400 × g per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di soluzione di colorazione di vitalità fissabile e incubare i campioni per 30 minuti a 4 °C.
  11. Aggiungere 1 mL di DPBS freddo al campione e centrifugare i campioni a 300 × g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e aggiungere 100 μL di soluzione colorante CD16/CD32 (1/200 in tampone FACS). Agitare per ~5 s e incubare per 10 minuti a 4 °C.
    NOTA: La colorazione CD16/CD32 è un pretrattamento per ridurre al minimo il legame non specifico degli anticorpi alle cellule portatrici di FcR, come la microglia, prima di applicazioni come la citometria a flusso.
  12. Aggiungere 1 mL di tampone FACS al campione e centrifugare a 300 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e aggiungere 100 μL di colorante master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G in 1x tampone FACS). Incubare i campioni per 20 minuti a 4°C al buio.
  13. Aggiungere 1 mL di tampone FACS al campione e centrifugare a 300 × g per 5 minuti.
  14. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone di fissaggio. Incubare a 4 °C per 25 min.
  15. Aggiungere 2 mL di tampone 1x permeabilizzazione (PERM) e centrifugare 300 × g per 5 minuti.
  16. Scartare il surnatante e aggiungere 100 μL di vGLUT1 o di soluzione colorante per il controllo dell'isotipo. Agitare per ~5 s e incubare i campioni a 4 °C per 50 min.
  17. Aggiungere 2 mL di 1x tampone PERM e centrifugare 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante e aggiungere 2 mL di tampone FACS ai campioni.
  18. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 250 μL di tampone FACS e far passare i campioni attraverso un filtro filtrante da 40 μm.
  19. Analizza l'intensità della fluorescenza vGLUT1 da microglia singola/vitale/CD11b++/CD45+ utilizzando la citometria a flusso. Utilizzare i macrofagi della milza come controllo negativo per ogni esperimento.
    1. Isolare gli splenociti comprimendo delicatamente il tessuto della milza tritato attraverso un filtro a filtro da 70 μm due volte. Sciacquare i filtri con 40 mL di DPBS e raccogliere la sospensione in una provetta conica da 50 mL.
    2. Centrifugare 350 × g per 10 minuti e risospendere il pellet risultante in una soluzione da 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi. Incubare per 10 minuti con ghiaccio.
    3. Aggiungere 10 mL di DPBS al campione dopo l'incubazione e centrifugare a 350 × g per 10 min.
    4. Procedere con i passaggi di colorazione spiegati tra i passaggi 1.11 e 1.17.
      NOTA: La strategia di gating è fornita nella Figura S2 supplementare per definire i macrofagi della milza come CD11b ++/ CD45 ++/ Popolazione di cellule vitali.
    5. Strategia di gating (Figura 1)
      1. Cancello primario: Regolare l'area di dispersione anteriore (FSC-A) [asse x] e l'area di dispersione laterale (SSC-A) [asse y] per includere la popolazione di microglia nell'area recintata ed escludere i detriti cellulari.
      2. Regolare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) [asse x] e l'altezza di dispersione in avanti (FSC-H) [asse y] per escludere i doppietti. I singoletti appaiono come una diagonale su questo grafico a punti.
      3. Regolare CD11b-PECy7 [asse y] e CD45-APC [asse x] e portare la popolazione con un alto livello superficiale di CD11b e un livello medio di CD45 come microglia.
      4. Escludere le celle morte nel gate negativo FITC[asse y]. FACOLTATIVO: Escludere anche le cellule positive per Ly6C- e Ly6G-FITC nel gate FITC negativo per escludere dall'analisi i macrofagi associati al SNC.
        NOTA: A differenza delle cellule vive, le cellule morte con membrane compromesse consentono al colorante di vitalità fissabile di entrare nel citoplasma, aumentando la quantità di marcatura delle proteine18. Pertanto, le cellule morte saranno più luminose delle cellule vive, che sono incluse nel cancello definito.
      5. Regolare CD45-APC [asse x] e vGLUT1-PE [asse y]; la popolazione che si trova al di sopra del cancello di soglia, in cui non sono stati rilevati eventi positivi nel campione di milza (controllo biologico interno negativo, Figura 1E) è considerata la frazione vGLUT1-positiva nel campione.

2. Rilevamento dell'engulfment in vitro di sinaptosomi grezzi da parte della microglia

  1. Preparazione del sinaptosoma grezzo e marcatura con pHrodo Red
    NOTA: Tutti i passaggi seguenti devono essere eseguiti su ghiaccio.
    1. Seguire i passaggi da 1.1 a 1.2.
    2. Trasferisci il cervello in una capsula di Petri riempita con 1 ml di terreno di cellule neurali ghiacciato e seziona attentamente l'ippocampo. Conservare sempre la capsula di Petri in ghiaccio. Usa l'ippocampo per l'isolamento della microglia nel passaggio successivo.
    3. Trasferire il resto del cervello (escluso il cervelletto e il bulbo olfattivo) in un omogeneizzatore Dounce riempito con 1 ml di reagente per l'estrazione di proteine sinaptiche e dissociare delicatamente il tessuto utilizzando il pestello sciolto con circa ~ 30 colpi. Integrare l'inibitore della proteasi in una compressa per 10 ml di reagente di estrazione e isolare i sinaptosomi secondo le istruzioni del produttore.
      NOTA: I reagenti per l'estrazione di proteine sinaptiche, come SynPER19, vengono utilizzati per preparare sinaptosomi che contengono proteine pre e postsinaptiche biologicamente attive.
    4. Sciogliere il pellet di sinaptosoma grezzo in 500 μL di soluzione 0,1 M Na2CO3 . Colorare il campione di sinaptosoma con 10 μL di pHrodo Red da 0,2 mM. Incubare i campioni di sinaptosoma grezzo a temperatura ambiente (24-25 °C) per 1,5 ore agitando delicatamente.
    5. Aggiungere 1 mL di DPBS freddo sul campione, centrifugare per 1 minuto alla massima velocità (20,815 × g) e aspirare il surnatante.
    6. Ripetere il passaggio 2.1.5 per 7 volte in totale per rimuovere il pHrodo Red in eccesso non legato dai campioni.
    7. Dopo l'ultima centrifugazione, eseguire un test standard di BCA per quantificare le concentrazioni proteiche del campione.
    8. Opzionale: congelare i campioni di sinaptosoma in DPBS con DMSO al 5% utilizzando azoto liquido e conservarli per 3 settimane a -80 °C. Copri i tubi con un foglio di alluminio per mantenere l'esposizione alla luce minima.
  2. In vitro Saggio di inghiottimento dei sinaptosomi grezzi utilizzando microglia adulta appena isolata
    1. Preparare l'aCSF ed equilibrarlo con il 95% di O2:5% di CO2 per 30 min.
      NOTA: Per i passaggi 2.2.2-2.2.4, seguire le istruzioni del produttore per la preparazione della soluzione digestiva a base di papaina.
    2. Aggiungere 4 mL di aCSF al flaconcino 2 del kit di papaina. Mettere la fiala in un bagnomaria a 37 °C per ~10 minuti fino a quando la soluzione di papaina appare limpida.
    3. Aggiungere 400 μL di aCSF al flaconcino 3 del kit di papaina. Miscelare delicatamente per ~10 volte mediante pipettaggio lento.
    4. Aggiungere 200 μl dal flaconcino 3 al flaconcino 2 (ricostruito al punto 2.2.3). Conservare il resto della fiala 3.
    5. Prendi l'ippocampo sezionato al punto 2.1.2 e trita l'ippocampo sezionato usando un bisturi.
    6. Trasferire l'ippocampo tritato in una provetta dissociatrice tissutale riempita con 2 mL di soluzione enzimatica preparata al punto 2.2.5. Posizionare la provetta nel dissociatore tissutale ed eseguire il programma: 37C_ABDK_01 (richiede ~30 min).
    7. Mettere i campioni in un bagno d'acqua a 37 °C per ~20 minuti e triturare la miscela ogni 5 minuti utilizzando una pipetta da 1 ml senza formare bolle.
      NOTA: Questo processo deve essere continuato fino a quando il tessuto non è completamente dissociato e appare completamente omogeneo per garantire una dissociazione efficiente. Tutte le seguenti fasi di centrifugazione vengono eseguite a 4 oC, se non diversamente specificato.
    8. Rimuovere con cautela la sospensione di cellule torbide in una nuova provetta da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti.
    9. Durante questo periodo di 5 minuti, preparare la seguente miscela di lavaggio (5 ml) per campione; aggiungere 500 μL di soluzione ricostituita di inibitore dell'albumina-ovomucoide fornita nel kit della papaina a 4,5 mL di aCSF. Aggiungere la soluzione rimanente nel flaconcino 3 del passaggio 2.2.5 alla miscela di lavaggio.
    10. Eliminare il surnatante del passaggio 2.2.8 e risospendere immediatamente il pellet cellulare nella soluzione di miscelazione di lavaggio.
    11. Passare il campione attraverso un filtro da 70 μm a una nuova provetta per microcentrifuga da 5 mL. Centrifugare i campioni a 300 × g per 5 minuti.
    12. Procedere con la fase di centrifugazione in gradiente Percoll spiegata in precedenza nei passaggi 1.7-1.9.
    13. Risospendere accuratamente le cellule nel tampone di colorazione MACS pipettando lentamente su e giù. Incubare i campioni per 15 minuti a 4 °C.
    14. Aggiungere 1 mL di tampone MACS a ciascun campione e centrifugare a 300 × g per 8 minuti.
    15. Risospendere le cellule in 500 μL di tampone MACS.
    16. Posizionare le colonne di selezione positive nel separatore magnetico. Equilibrare le colonne risciacquandole con 3 mL di tampone MACS.
    17. Miscelare delicatamente e applicare 500 μl di sospensione cellulare sulla colonna. Lavare le colonne 3 volte con 3 mL di tampone MACS.
    18. Rimuovere le colonne dal separatore magnetico e posizionarle su provette coniche da 15 mL. Aggiungere 5 mL di tampone MACS sulla colonna e sciacquare immediatamente le cellule con un plumper. Centrifugare i campioni a 300 × g per 10 minuti.
    19. Durante questo periodo, preparare 20 ml di FBS al 40% in DPBS. Preriscaldare 1 mL di DMEM per campione fino a 37 °C a bagnomaria.
    20. Sciogliere il pellet cellulare finale in 1 mL di DMEM preriscaldato. Semina circa ~150.000-200.000 cellule in 500 μL di DMEM preriscaldato per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Come controllo, seminare un numero simile di cellule in 1-2 pozzetti extra. Controllare la confluenza delle cellule in tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico.
      NOTA: Se la regione cerebrale bersaglio è l'ippocampo o regioni cerebrali relativamente piccole, è possibile raggruppare 5 topi per campione (n) per isolare ~150.000 microglia. Per l'intero cervello, 1 topo su n sarà sufficiente per ottenere un numero simile di cellule utilizzando entrambi i protocolli di isolamento. In alternativa, ~40.000 cellule possono essere piastrate in piastre da 96 pozzetti in un volume finale di 100 μL per avviare il saggio di inghiottimento. Ciò riduce il numero di cellule analizzate, ma riduce anche il numero di topi utilizzati per n. La deprivazione proteica dovuta alla mancanza di FCS nel DMEM innescherà la fagocitosi.
    21. Incubare la piastra per 1-2 ore nell'incubatore (37 °C e 5% CO2).
      NOTA: Questa fase mira a far sì che le cellule si riprendano dagli effetti inclini allo stress della procedura di isolamento prima dell'inizio del saggio di inghiottimento funzionale.
    22. Prelevare 250 μL di terreno da ciascun pozzetto molto lentamente, aggiungere 250 μL di DMEM fresco preriscaldato a ciascun pozzetto e aggiungere 3 μg di sinaptosomi marcati con pHRodo Red sulla parte superiore. Controllare la confluenza cellulare in tutti i pozzetti utilizzando un microscopio ottico.
      1. Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere la stessa quantità di sinaptosomi non marcati al pozzetto extra seminato con le cellule.
      2. Per i pozzetti di prova, assicurarsi che il pozzetto 1 contenga solo celle; il pozzetto 2 contiene cellule+ sinaptosomi non marcati; pozzetto-3 contiene cellule + 3 μg di pHrodo Red; il pozzetto 4 contiene DMEM + 3 μg di pHrodo Red.
    23. Incubare le cellule con i sinaptosomi per 2 ore nell'incubatore (37 °C e 5% di CO2).
    24. Estrarre il terreno e lavare i pozzetti con DPBS freddo. Aggiungere 200 μl di soluzione di tripsina/EDTA per pozzetto per staccare le celle per 35 s.
    25. Aggiungere 1 mL di FBS al 40% in DPBS per pozzetto e trasferire le cellule in una provetta di polipropilene da 5 mL attraverso il colino. Tenere sia la piastra che la provetta sul ghiaccio durante questo processo per facilitare il distacco delle cellule.
    26. Lavare ogni pozzetto 2 volte utilizzando 500 μl di DPBS ghiacciato. Centrifugare i campioni raccolti a 500 × g per 5 min.
    27. Risospendere le cellule nella soluzione colorante contenente 1/200 di CD16/CD32 in 100 μL di tampone FACS e incubare per 10 minuti su ghiaccio.
    28. Dopo l'incubazione, aggiungere CD11b e CD45 alla soluzione colorante con una concentrazione finale di 1/100 da ciascuno. Incubare i campioni per 20 minuti a 4 °C al buio.
    29. Lavare i campioni con 1 mL di tampone FACS e centrifugarli a 300 × g per 10 minuti.
    30. Risospendere il pellet in 250 μL di tampone FACS e registrare almeno 100.000 eventi totali utilizzando la citometria a flusso. Analizza l'intensità della fluorescenza di pHrodo Red dalla microglia CD11b++/CD45+ .
    31. Strategia di gating (Figura 2C)
      1. Regolare il cancello primario: Forward Scatter Area (FSC-A) [asse x] e Side Scatter Area (SSC-A) [asse x] per includere la popolazione di microglia nell'area gated ed escludere i detriti cellulari.
      2. Regolare l'area di dispersione in avanti (FSC-A) [asse x] e l'altezza di dispersione in avanti (FSC-H) [asse y] per escludere i doppietti. I singoletti appaiono come una diagonale su questo grafico a punti.
      3. Regolare CD11b-PECy7 [asse y] e CD45-APC [asse x] e selezionare la popolazione con CD11b di alto livello superficiale e livello medio di CD45 come microglia.
      4. Calcola l'intensità mediana di fluorescenza di pHrodo-PE da questa popolazione. Utilizzare le stesse cellule incubate con sinaptosomi non marcati come controllo negativo.

Representative Results

In questo progetto, abbiamo ottimizzato e presentato due protocolli per misurare l'inghiottimento in vivo* e in vitro delle sinapsi da parte della microglia. Nel primo protocollo, ci siamo concentrati sull'engulfment in vivo* delle sinapsi vGLUT1-positive. Come punto di partenza, abbiamo utilizzato un protocollo14 pubblicato in precedenza. Tuttavia, gli anticorpi FACS utilizzati in questo protocollo sono stati interrotti e abbiamo aggiunto molte fasi di ottimizzazione, nonché un nuovo metodo per l'isolamento della microglia16. Ecco perché vale la pena condividere con la comunità scientifica il protocollo qui presentato come aggiornamento completo dei protocolli già pubblicati.

Per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi, abbiamo utilizzato topi maschi C57BL/6N di età compresa tra 11 e 14 settimane. L'ippocampo è stato selezionato come principale regione di interesse a causa del suo alto grado di rimodellamento sinaptico e plasticità12. Abbiamo analizzato la microglia %vGLUT1-positiva e l'intensità di fluorescenza (MFI) vGLUT1-PE specifica per microglia nell'ippocampo di topi C57BL/6N. I macrofagi della milza derivati dagli stessi animali sono stati utilizzati come controllo biologico negativo per ogni esperimento. Abbiamo testato l'anticorpo vGLUT1 dimostrando un segnale di fluorescenza vGLUT1-PE più elevato dalla microglia ippocampale rispetto al controllo dell'isotipo e ai macrofagi della milza (Figura 1B-E)

Inoltre, abbiamo confrontato l'inghiottimento microgliale delle sinapsi nel cervelletto e nel bulbo olfattivo (come un altro riferimento per l'elevata plasticità sinaptica)20. Abbiamo trovato un segnale di fluorescenza vGLUT1 più alto nella microglia dal bulbo olfattivo e un segnale più basso nel cervelletto rispetto all'ippocampo (Figura 1F). L'intensità del segnale più bassa è stata rilevata nei macrofagi della milza, fungendo da controllo negativo interno (Figura 1E). Inoltre, abbiamo utilizzato topi Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP per testare l'immunoreattività del nostro anticorpo vGLUT1. YFP è espresso dai neuroni glutammatergici di questi topi, indicando che la popolazione YFP-positiva dovrebbe includere anche una frazione vGLUT1-positiva. Utilizzando questo protocollo di colorazione, abbiamo rilevato il 98,7% della popolazione YFP-positiva come vGLUT1-positiva, convalidando l'efficienza del nostro anticorpo (Figura supplementare S3).

Nel complesso, questi risultati convalidano l'efficienza dell'anticorpo vGLUT1 e del protocollo di colorazione presentato. Dimostriamo che questo protocollo e l'anticorpo possono essere utilizzati con sicurezza per quantificare l'inghiottimento in vivo* delle sinapsi in modo rapido e ad alto rendimento rispetto ad altri approcci sperimentali.

Passando al metodo in vitro , abbiamo isolato le microglia adulte e le abbiamo incubate con sinaptosomi marcati con pHrodo Red appena isolati dagli stessi animali per quantificare il loro inghiottimento in vitro (Figura 2A). Abbiamo marcato i sinaptosomi con pHrodo Red, che aumenta naturalmente il segnale di fluorescenza nel pH acido circostante21. Abbiamo appena isolato i sinaptosomi e li abbiamo esposti a diversi valori di pH (pH = 4 e pH = 11). Dopo aver confermato l'aumento del segnale di fluorescenza a pH basso come esperimento di prova di principio (Figura 2B), abbiamo incubato questi sinaptosomi con microglia appena isolate per 1,5-2 ore. Come controllo, abbiamo incubato la microglia con sinaptosomi non marcati. Successivamente, abbiamo analizzato il segnale di fluorescenza pHrodo Red-PE dalla microglia CD11b++/CD45+ e abbiamo osservato una fluorescenza PE positiva, paragonabile a quella ottenuta dai sinaptosomi a pH = 4 (Figura 2C). Pertanto, questo metodo fornisce un'analisi rapida e ad alto rendimento dell'inghiottimento in vitro dei sinaptosomi e può essere esteso alle placche amiloidi o all'inghiottimento di altri potenziali bersagli seguendo le necessarie fasi di ottimizzazione. Infatti, Rangaraju et al. hanno quantificato l'inghiottimento dell'amiloide-beta da parte della microglia utilizzando un approccio simile basato sulla citometria a flusso22. In conclusione, questi due metodi forniscono una quantificazione robusta, efficiente e ad alto rendimento dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi sia in vivo* che in vitro.

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Figura 1: Analisi dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1+ in vivo*. (A) Illustrazione grafica del flusso di lavoro sperimentale che descrive le fasi della colorazione intracellulare di vGLUT1. (B) Strategia di gating per definire una popolazione cellulare vitale singola/CD11b++/CD45+/ dall'ippocampo. Questa popolazione è stata utilizzata per analizzare vGLUT1-MFI e per quantificare la percentuale di microglia vGLUT1+ nell'ippocampo. Il gate mostrato con il rettangolo rosso indica la frazione di celle vGLUT1+ nel campione totale. (C) L'istogramma indica l'intensità della fluorescenza di vGLUT1-PE. (D) Il cancello mostrato con il rettangolo rosso indica che non c'è alcuna frazione cellulare positiva che mostri immunoreattività all'isotipo-PE. L'istogramma indica l'intensità della fluorescenza Isotype-PE. (E) Il cancello mostrato con il rettangolo rosso indica che non c'è alcuna frazione cellulare positiva che mostra immunoreattività vGLUT1-PE nei macrofagi della milza. L'istogramma indica l'intensità della fluorescenza vGLUT1-PE. Il gate indicato sull'istogramma inizia al livello in cui termina il vGLUT1-MFI dalla milza (~104) e viene utilizzato per analizzare la frazione positiva vGLUT1 nei campioni di cervello. (F) L'istogramma sovrapposto mostra il confronto dell'intensità di fluorescenza dell'EP dei macrofagi della milza (grigio) e della microglia dell'ippocampo (rosso), del cervelletto (viola) e del bulbo olfattivo (azzurro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Analisi dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi dei sinaptosomi in vitro. (A) Illustrazione grafica del flusso di lavoro sperimentale che illustra le fasi del saggio di inghiottimento dei sinaptosomi in vitro. (B) I sinaptosomi incubati a due diversi valori di pH mostrano un basso segnale di fluorescenza pHrodo Red-PE a pH = 11 e un'alta fluorescenza pHrodoRed-PE a pH = 4. (C) Per analizzare l'intensità della fluorescenza di pHrodo Red-PE è stata utilizzata una popolazione cellulare singola/CD11b++/CD45+ . Le microglia incubate con sinaptosomi non colorati sono state utilizzate come controllo negativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei tamponi e dei reagenti utilizzati in questo protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Immagine rappresentativa di microglia adulta appena isolata. Immagine acquisita utilizzando un microscopio ottico con obiettivo 20x seguendo il protocollo di dissociazione tissutale a base di papaina e l'isolamento della microglia CD11b+ basato su MACS. Barra della scala = 50 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Grafici FACS rappresentativi che dimostrano la strategia di gating per definire i macrofagi della milza. La milza è stata utilizzata come controllo negativo negli esperimenti sperimentali durante il test dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi nell'ippocampo. I grafici FACS riportati sopra definiscono i macrofagi della milza come CD11b++/CD45++/popolazione vitale. Questa popolazione è stata utilizzata per impostare una soglia per quantificare la microglia vGLUT1+ nei campioni di cervello che risiedono al di sopra di questo cancello di soglia. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S3: Grafici FACS rappresentativi che dimostrano la strategia di gating per testare l'efficienza dell'anticorpo vGLUT1. (A) Illustrazione grafica del flusso di lavoro sperimentale che descrive le fasi della colorazione vGLUT1. I neuroni glutammatergici YFP+ sono stati utilizzati per testare l'immunoreattività dell'anticorpo vGLUT1. (B) Strategia di gating per definire la popolazione YFP+ dall'ippocampo di topi Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP che sono stati utilizzati come controllo positivo per testare l'efficienza dell'anticorpo vGLUT1 FACS. La frazione YFP+ è stata gated per specificare le sinapsi glutammatergiche. In questa popolazione, l'immunoreattività dell'anticorpo vGLUT1 è stata analizzata per testare l'immunoreattività dell'anticorpo. Rispetto al controllo isotipico (C); Il 97,9% della frazione cellulare YFP-positiva viene rilevata come (D) vGLUT1-positivo. (E) L'istogramma sovrapposto indica il confronto della fluorescenza PE tra l'isotipo e l'anticorpo vGLUT1. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Il raffinamento sinaptico attraverso l'interazione microglia-sinapsi è un'intrigante area di studio nel campo della neuroimmunologia, che offre intuizioni promettenti sul ruolo della microglia nei disturbi neurodegenerativi e dello sviluppo neurologico. Nel 2011; Paolicelli et al. hanno fornito prove della presenza di materiale sinaptico all'interno della microglia, facendo luce sul loro coinvolgimento nel processo di inghiottimento sinaptico4. Un altro studio intrigante ha utilizzato l'imaging time-lapse e un modello di coltura di fetta di cervello organotipico ex vivo e ha riportato che le microglia si impegnano in un processo fagocitario noto come trogocitosi, in cui inghiottono le strutture presinaptiche piuttosto che l'intera struttura sinaptica23. Una pubblicazione molto recente che utilizza un nuovo modello murino transgenico che consente la misurazione della fagocitosi nel tessuto intatto ha mostrato la potatura da parte di Bergmann-glia in vivo dopo l'apprendimento motorio24. Pertanto, ci sono prove sufficienti che indicano il coinvolgimento delle cellule gliali nell'inghiottimento sinaptico, compresa la microglia. Tuttavia, la misura in cui questa funzione microgliale influisce sul processo dinamico e selettivo della potatura sinaptica richiede ulteriori prove.

Tuttavia, la quantificazione dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi funge da indicatore prezioso e fornisce una visione parziale delle complesse dinamiche delle interazioni microglia-sinapsi, in particolare il raffinamento sinaptico. Una revisione completa ha riassunto gli attuali protocolli utilizzati per studiare l'inghiottimento delle sinapsi da parte della microglia25. Ci teniamo a sottolineare che i nostri protocolli sono ottimizzati sulla base di protocolli esistenti già in uso. I metodi presentati in questo studio forniscono una quantificazione rapida e ad alto rendimento dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi in varie regioni cerebrali sezionate. A seconda della regione del cervello, per entrambe le metodologie è possibile un'analisi di almeno 10.000 cellule microgliali in un massimo di due giorni, il che le rende preziose per testare più modelli murini in parallelo.

Riconosciamo che la quantificazione della microglia vGLUT1+ comprende sia l'inghiottimento in vivo che quello ex vivo a breve termine fino alla fase di fissazione. Pertanto, suggeriamo che il nostro test presenti un modo rapido e affidabile per quantificare il materiale sinaptico all'interno della microglia come passo iniziale prima della convalida in vivo utilizzando approcci come l'IHC.

Un altro svantaggio dell'analisi di citometria a flusso è la limitata disponibilità di anticorpi per i marcatori sinaptici, in particolare per le sinapsi inibitorie. È difficile trovare anticorpi direttamente coniugati disponibili in commercio che mostrino un segnale luminoso per questi marcatori. Dato l'ampio tempo di ottimizzazione necessario per testare diversi anticorpi che prendono di mira i marcatori sinaptici, è importante condividere le procedure ben ottimizzate con la comunità scientifica per la colorazione intracellulare con diversi anticorpi, come facciamo qui con questo studio.

Per quanto riguarda l'analisi dei dati in questo studio, abbiamo utilizzato i controlli isotipici come controlli tecnici negativi per tenere conto dei legami non specifici dell'anticorpo vGLUT1, poiché forniscono una stima del legame non specifico di un anticorpo in un campione, ottimizzando al contempo i saggi basati sulla citometria a flusso26. Tuttavia, i controlli isotipici sono stati per lo più ottimizzati per rilevare il segnale di fondo aspecifico dalle procedure di colorazione superficiale e non sono ottimali per i controlli di colorazione intracellulare27,28. Pertanto, non si dovrebbe fare affidamento su di essi per distinguere tra le popolazioni negative e positive quando si esegue la colorazione intracellulare, che comporta fasi di fissazione e permeabilizzazione che possono influire sul rilevamento dell'antigene, sull'autofluorescenza e sulla luminosità del fluoroforo29. Tali procedure di colorazione intracellulare richiedono l'uso di appropriati controlli biologici interni per definire la popolazione cellulare positiva colorata per un marcatore intracellulare29. Quindi, considerando che utilizziamo un protocollo di colorazione intracellulare, abbiamo impiegato un controllo biologico negativo interno (macrofagi della milza) e definito il confine tra le popolazioni positive e negative in base ai macrofagi della milza isolati dagli stessi topi. Abbiamo distinto la popolazione positiva sopra il cancello, in cui non ci sono eventi positivi vGLUT1 dai macrofagi della milza che fungono da controllo biologico negativo (Figura 1).

Entrambi i metodi presentati in questo studio offrono un grande potenziale per l'analisi iniziale dell'inghiottimento microgliale delle sinapsi in modo rapido e ad alto rendimento, analizzando oltre 10.000 cellule da piccole regioni cerebrali e questo non è realizzabile con le tecniche di microscopia standard. Pertanto, questi metodi offrono un vantaggio significativo rispetto ai metodi laboriosi e dispendiosi in termini di tempo e, inoltre, forniscono un'analisi più completa dell'inghiottimento sinaptico consentendo un'analisi di un numero maggiore di microglia. Inoltre, il metodo in vitro presentato in questo studio è particolarmente utile per testare l'impatto di diversi trattamenti sull'inghiottimento microgliale delle sinapsi. Consente la quantificazione diretta dell'effetto del trattamento sulla microglia senza i fattori confondenti associati ad altri tipi di cellule. Inoltre, serve come approccio indiretto per dimostrare un potenziale effetto del microambiente o di altri tipi di cellule sul processo di inghiottimento sinaptico. Pertanto, concludiamo che questi metodi, specialmente se usati in parallelo, offrono alternative intuitive e vantaggiose per l'analisi dell'inghiottimento microgliale di materiali sinaptici.

Tuttavia, l'analisi delle microglia appena isolate mediante saggi fagocitici basati su FACS ex vivo può presentare alcuni svantaggi. In primo luogo, è fondamentale impiegare protocolli ben ottimizzati che generino microglia appena isolate dal cervello adulto, evitando l'attivazione ex vivo e la risposta allo stress della microglia. Dissing-Olesen et al. hanno incorporato l'uso di inibitori trascrizionali e traduzionali per superare questo problema impiegando una procedura di dissociazione tissutale a 37 oC30. Mattei et al., d'altra parte, hanno presentato un protocollo di dissociazione tissutale meccanica a freddo per evitare di indurre l'espressione ex vivo dei geni associati allo stress16 e abbiamo adattato questo protocollo nella prima sezione per evitare l'attivazione ex vivo della risposta della microglia associata allo stress prima della colorazione intracellulare vGLUT1. Abbiamo impiegato un protocollo di dissociazione tissutale enzimatica nella seconda sezione prima del saggio di inghiottimento dei sinaptosomi in vitro , considerando la maggiore resa delle microglia dopo la dissociazione tissutale a base di papaina (dati non mostrati). Le microglia rimangono inevitabilmente a 37 oC in condizioni di coltura quando incubate con sinaptosomi, e l'incubazione a 37 oC può infatti indurre cambiamenti nelle microglia come svantaggi comuni di tutti i saggi in vitro e le procedure di coltura cellulare. Pertanto, suggeriamo l'uso di entrambi i protocolli presentati in parallelo per raggiungere una conclusione più ampia in termini di inghiottimento microgliale delle sinapsi.

Inoltre, è importante definire attentamente la strategia di gating per selezionare la microglia CD11b++/CD45+ tenendo conto della presenza di altre cellule immunitarie nel parenchima cerebrale che esprimono anche questi marcatori31. Ancora più importante, quando si scelgono marcatori per colpire specificamente la microglia (ad esempio, TMEM119, P2RY12), è importante considerare che possono subire cambiamenti nei loro livelli di espressione durante condizioni patologiche e infiammatorie32, e tali cambiamenti dovrebbero essere considerati prima di stabilire il pannello FACS per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi. Infine, è essenziale sottolineare che nessuno dei metodi discussi in precedenza, inclusi gli approcci in vivo basati su IHC e microscopia, può da solo catturare la potatura attiva e selettiva delle sinapsi da parte della microglia. Questi metodi non sono in grado di discriminare la potatura attiva da parte della microglia dallo scavenging passivo dei detriti sinaptici all'interno del parenchima cerebrale. Pertanto, quando si valutano e si discutono i dati, è imperativo distinguere chiaramente tra questi concetti distinti.

Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgements

Ringraziamo Regina Piske per l'assistenza tecnica con l'isolamento delle microglia e il Dr. Caio Andreta Figueiredo per il suo aiuto con l'acquisizione delle immagini al microscopio nella Figura S1 supplementare. Ringraziamo la struttura FACS dell'MDC per il supporto tecnico. Questo manoscritto presenta parzialmente i dati rappresentativi presentati al Brain, Behavior and Immunity Journal nel 2024. La Figura 1A, la Figura 2A e la Figura S3A supplementare sono state create utilizzando BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Dounce HomogenizerActive MotifCat# 40401
5 mL TubesEppendorfCat# 0030119452
Anti-CD11bThermoFisher ScientificCat# 25-0112-82
Anti-CD45BDCat# 559864
Anti-Ly6CBDCat# 553104
Anti-Ly6GBDCat# 551460
BCA Protein Assay KitPierceCat# 23227
C-TubesMiltenyi BiotechCat# 130-096-334
CD11b MicroBeadsMiltenyi BiotechCat# 130-093-634
CD16/CD32 AntibodyThermo Fisher ScientificCat#14-0161-82
Cytofix/Cytoperm KitBDCat# 554714
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoCat# 41966029
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline  (DPBS)GibcoCat# 14190144
Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes Thermo Fisher ScientificCat# 08-771-23
fixable viability dyeThermo Fisher ScientificCat# L34969
Hibernate A mediumThermoFisherCat# A1247501
LS-columnsMiltenyi BiotechCat# 130-042-401
Papain Dissociation SystemWorthingtonCat# LK003150
PercollTh.GeyerCat# 17-0891-02
Petri dishesThermo Fisher ScientificCat# 11339283
pHrodoRedThermo Fisher ScientificCat# P36600
Protease inhibitorRocheCat# 5892970001
Red Blood Cell Lysis BufferSigma Cat# 11814389001
Steritop E-GP Sterile Filtration SystemMerckCat# SEGPT0038
SynPer SolutionThermoFisherCat# 87793
vGLUT1 AntibodyMiltenyi BiotechCat# 130-120-764

References

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