שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

Abstract

חדירות כלי דם היא גורם מפתח בפיתוח טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל פגוע, כגון תפקוד לקוי של האנדותל בעורקים הכליליים ותפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח. טכניקות הייצור הקיימות אינן משכפלות כראוי את השונות הגיאומטרית ברשתות כלי הדם בגוף האדם, המשפיעה באופן משמעותי על התקדמות המחלה; יתר על כן, טכניקות אלה כוללות לעתים קרובות הליכי ייצור רב-שלביים המעכבים את הייצור בתפוקה גבוהה הדרושה לבדיקות פרמקולוגיות. מאמר זה מציג פרוטוקול הדפסה ביולוגית ליצירת רקמות כלי דם מרובות עם דפוסים וגדלים רצויים ישירות על לוחות סטנדרטיים של שש בארות, תוך התגברות על אתגרי הרזולוציה והפרודוקטיביות הקיימים בטכנולוגיית הדפסה ביולוגית. גישת ייצור פשוטה הוקמה כדי לבנות שש תעלות חלולות וניתנות לבודר בתוך הידרוג'ל, אשר לאחר מכן רופדו בתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים ליצירת אנדותל פונקציונלי ובשל. האופי הנשלט על ידי מחשב של הדפסה ביולוגית בתלת-ממד מבטיח יכולת שחזור גבוהה ודורש פחות שלבי ייצור ידניים בהשוואה לשיטות מסורתיות. זה מדגיש את הפוטנציאל של VOP כפלטפורמה יעילה בעלת תפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם וקידום גילוי תרופות.

Introduction

רשת כלי הדם בכל גוף האדם מתפקדת כמחסום תחבורה חיוני על ידי ויסות דינמי של חילופי מולקולות ותאים בין הדם והרקמות הסובבות. ויסות זה חיוני למניעת בצקת רקמות ומאפשר חילופי חומרים מזינים ותאים סלקטיביים, ובכך תומך בחילוף חומרים ברקמה והומאוסטזיס¹. חדירות אנדותל משתנה, גורם במצבים בריאותיים רבים, משפיעה הן על חומרת המחלה והן על יעילות הטיפול². אנדותל כלי הדם פועל כמחסום סלקטיבי, המאפשר את המעבר בין כלי דם, רקמות ואיברים. ויסות זה כרוך במספר מנגנונים, כגון סינון בסיסי של מומסים ומולקולות קטנות, שיבוש מכוון של מחסום כלי הדם, והשפעת מולקולות כגון פרוסטגלנדינים וגורמי גדילה על רמות חדירות

Protocol

1. יצירת קוד G עבור המדפסת הביולוגית

1. כדי ליצור ולהציג באופן חזותי את נתיב ההדפסה, בקר בכלי סימולציה מקוון של G-code (לדוגמה, NCviewer).
2. לחץ על קובץ חדש סמל בממשק כדי ליצור קובץ G-code חדש.
3. צור נתיב הדפסה על-ידי כתיבה ידנית של פקודות G-code עבור ערוץ ההקר?.......

Discussion

תוך ניצול הדיוק, האוטומציה והאופי הנשלט על ידי מחשב של טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, ביססנו שיטה יעילה לייצור תעלות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות, שנבחרו בשל התאמתם לקוראי מיקרו-לוחות מסחריים ולמערכי הדמיה במיקרוסקופ. עיצוב הלוח יכול להכיל ערוצים מרובי ג?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipette	SPL	SPL 91010
10 mL syringe	Shinchang Medical
15 mL conical tube	SPL	50015
3D Bioprinter	T&R Biofab	3DX-Printer
6-well plate	SPL	37206
Biological Safety Cabinets	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Brightfield Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Culture Flask 75T	SPL	70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354230
Distilled water
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Cell Culture Grade	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Fluorescent beads (1.0 μm, green)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g	3D Materials	20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL	Gibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)	Thermo Fisher	L3224
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder	Tokoyo Chemical Industry CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, Counting chamber cover	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrifuge	eppendorf	Centrifuge 5920 R
NCViewer.com
Nitrogen tank	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Planetary Mixer	THINKY CORPORATION, japan	ARE-310
Plasma treatment machine	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Reagent storage cabinet	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging Microscope	Carl ZEISS
Refrigerator	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CacheBy	SL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Syringe Barrel Tip Cap	FISNAR	3051806
Tally counter	Control Company	C23-147-050
Tapered Nozzle (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Tapered Nozzle (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Tapered nozzle 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Thrombin from bovine plasma	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Timer, 4-channel	ETL	SL.Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin Neutralizing Solution	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-55
Water Bath	DAIHAN Scientific	WB-11
Weight machine	Sartorius	bce2241-1skr