A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים
In This Article
Summary
הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.
Abstract
מיקרוסקופ יריעות אור (LSM) ממלא תפקיד מרכזי בהבנת המבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) המורכב של הלב, ומספק תובנות חיוניות לגבי פיזיולוגיה בסיסית של הלב ותגובות פתולוגיות. אנו מתעמקים בזאת בפיתוח ויישום טכניקת LSM כדי להבהיר את המיקרו-ארכיטקטורה של הלב במודלים עכבריים. המתודולוגיה משלבת מערכת LSM מותאמת אישית עם טכניקות ניקוי רקמות, הפחתת פיזור האור בתוך רקמות הלב לצורך הדמיה נפחית. השילוב של LSM קונבנציונלי עם תפירת תמונה וגישות deconvolution multiview מאפשר ללכוד את הלב כולו. כדי להתמודד עם הפשרה המובנית בין רזולוציה צירית לשדה ראייה (FOV), אנו מציגים גם שיטת מיקרוסקופ יריעות אור שנסחף באופן אקסיאלי (ASLM) כדי למזער אור מחוץ למיקוד ולהאיר באופן אחיד את הלב לאורך כיוון ההתפשטות. בינתיים, שיטות ניקוי רקמות כגון iDISCO לשפר את חדירת האור, להקל על הדמיה של מבנים עמוקים ולהבטיח בדיקה מקיפה של שריר הלב לאורך הלב כולו. השילוב של שיטות LSM וניקוי רקמות המוצעות מהווה פלטפורמה מבטיחה לחוקרים בפתרון מבנים לבביים של מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצובה מחדש.
Introduction
אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים1. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו2. זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונ....
Protocol
פרוטוקולים וניסויים בבעלי חיים אושרו ונערכו תחת פיקוחה של אוניברסיטת טקסס בוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בדאלאס (IACUC #21-03). במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL6, כולל יילודים ביום 1 (P1) שלאחר הלידה ומבוגרים בני 8 שבועות. לא נצפה הבדל בין זכרים לנקבות. כל איסוף הנתונים ועיבוד התמונה לאחר מכן.......
Representative Results
LSM הוכח כמטפח מחקרי לב 31,32,33,34,35,36,37 בשל הסיכון המינימלי לנזק לצילום, רזולוציה מרחבית גבוהה וחתך אופטי בניגוד לשיטות הדמיה אופטיות אחרות כגון שדה בהיר וטכניקות סריקה נקודתית
Discussion
התקדמות שיטות ההדמיה, החישוב וניקוי הרקמות סיפקה הזדמנות חסרת תקדים לחקור באופן נרחב את מבנה הלב ותפקודו. זה טומן בחובו פוטנציאל גדול להעמקת ההבנה שלנו של מורפוגנזה ופתוגנזה של הלב באמצעות מודל לב מכרסם שלם. בניגוד למחקרי in vivo של לב דג זברה בגישה דומה 40,41,42,43, השילוב של טכניקות LSM מתקדמ?.......
Acknowledgements
אנו מביעים את תודתנו לקבוצתו של ד"ר אריק אולסון במרכז הרפואי UT Southwestern על שיתוף נדיב של דגמי בעלי החיים. אנו מעריכים את כל ההערות הבונות שסופקו על ידי חברי החממה D ב- UT דאלאס. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).
....Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Agarose | |||
| Low melting point agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| Deionized water | - | - | |
| Chemicals for tissue clearing | |||
| 5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, mixture of cis and trans | Sigma-Aldrich | 118184 | |
| D.E.R.™ 332 | Sigma-Aldrich | 31185 | |
| D.E.R.™ 736 | Sigma-Aldrich | 31191 | |
| Dibenzyl ether (DBE) | Sigma-Aldrich | 33630 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Fluorescent beads | Spherotech | FP-0556-2 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma-Aldrich | 216736 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 439193 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Thermo Fisher | 47392 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 79383 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Software and algorithms | |||
| Amira | Thermo Fisher Scientific | 2021.2 | |
| BigStitcher | Hörl et al.22 | ||
| Fiji-ImageJ | Schindelin et al.20 | 1.54f | |
| HCImage Live | Hamamatsu Photonics | 4.6.1.2 | |
| LabVIEW | National Instruments Corporation | 2017 SP1 | |
| Key components of the customized light-sheet system | |||
| 0.63 - 6.3X Zoom body | Olympus | MVX-ZB10 | |
| 10X Illumination objective | Nikon | MRH00105 | |
| 1X detection objective | Olympus | MV PLAPO 1X/0.25 | |
| 473nm DPSS Laser | Laserglow Technologies | LRS-0473-PFM-00100-05 | |
| 532nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0532-PFM-00100-05 | |
| 589 nm DPSS laser | Laserglow Technologies | LRS-0589-GFF-00100-05 | |
| BNC connector | National Instrument | BNC-2110 | |
| Cylindrical lens | Thorlabs | ACY254-050-A | |
| DC-Motor Controller, 4 axes | Physik Instrumente | C-884.4DC | |
| ETL | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| ETL Cable | Optotune | CAB-6-300 | |
| ETL Lens Driver | Optotune | EL-E-4i | |
| Filter | Chroma | ET525/30 | |
| Filter | Chroma | ET585-40 | |
| Filter | Chroma | ET645-75 | |
| Filter wheel | Shutter Instrument | LAMBDA 10-B | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.20DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | L-406.40DG10 | |
| Motorized translation stage | Physik Instrumente | M-403.4PD | |
| NI multifunction I/O | National Instrument | PCIe-6363 | |
| sCMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| Stepper motor | Pololu | 1474 | |
| Tube lens | Olympus | MVX-TLU |
References
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331,....
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved