Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Представлен протокол получения синтетических биомолекулярных конденсатов, состоящих из нанозвезд амфифильной ДНК, начиная с входящих в их состав ДНК-олигонуклеотидов. Конденсаты производятся либо из одного нанозвездного компонента, либо из двух компонентов и модифицируются для поддержания транскрипции РНК in vitro из встроенной матрицы ДНК.

Abstract

Синтетические капли и конденсаты становятся все более распространенными компонентами передовых биомиметических систем и синтетических клеток, где они могут быть использованы для создания компартментализации и поддержания жизненных реакций. Синтетические наноструктуры ДНК продемонстрировали значительный потенциал в качестве строительных блоков, образующих конденсат, благодаря своей программируемой форме, химической функционализации и способности к самосборке. Недавно мы продемонстрировали, что амфифильные ДНК-нанозвезды, полученные путем мечения ДНК-соединений гидрофобными фрагментами, представляют собой особенно надежное и универсальное решение. Полученные конденсаты амфифильной ДНК могут быть запрограммированы на отображение сложных, многокомпонентных внутренних архитектур, структурно реагировать на различные внешние стимулы, синтезировать макромолекулы, захватывать и высвобождать полезную нагрузку, подвергаться морфологическим трансформациям и взаимодействовать с живыми клетками. В данной работе мы демонстрируем протоколы получения конденсатов амфифильных ДНК, начиная с входящих в состав ДНК олигонуклеотидов. Мы рассмотрим (i) однокомпонентные системы, образующие однородные конденсаты, (ii) двухкомпонентные системы, образующие конденсаты ядро-оболочка, и (iii) системы, в которых конденсаты модифицируются для поддержки транскрипции наноструктур РНК in vitro .

Introduction

Синтетические клетки представляют собой устройства микрометрового масштаба (10-50 мкм), сконструированные снизу вверх для воспроизведения функций и структур существующих биологических клеток 1,2. Синтетические клетки часто связаны мембранами, состоящими из липидных двухслойных везикул 3,4,5,6,7, полимерсом 8,9 или протеиносом10,11, ко....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол разделен на три раздела. В разделе 1 описаны предварительные этапы, включая получение олигонуклеотидов ДНК и стеклянных капилляров. В разделе 2 описывается приготовление конденсатов типа С-звезда различных конструкций, в том числе одно- и двухкомпонентных, и их изв?.......

Representative Results

После отжига конденсаты C-звезды могут быть визуализированы непосредственно в капиллярной трубке или после экстракции, чтобы подтвердить их образование. Для всех вариантов конструкции C-звезды следует наблюдать отчетливые сферические или многогранные конденсаты диаметром примерно 10.......

Discussion

Описанный здесь протокол обеспечивает подход к получению одно- или двухкомпонентных конденсатов из нанозвезд амфифильной ДНК с вариациями конструкции для введения различных ответов в конденсаты. В соответствии с данным протоколом образуются конденсаты в буферном растворе 0,3 М NaCl в TE,.......

Acknowledgements

LM, LDM и DT выражают признательность Европейскому исследовательскому совету (ERC) за поддержку в рамках Программы исследований и инноваций Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). LDM выражает признательность за поддержку со стороны исследовательского гранта Королевского общества для научных сотрудников (RGF/R1/180043) и поддержки от исследовательской стипендии Университета Королевского общества (UF160152, URF/R/221009).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe filtersSigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel GläserVWR631-0853
2-PropanolSigma-Aldrich34683
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy GlueRSARA-400005
Bio-Rad C1000 thermal cyclerBio-Rad1851197
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking LidFisher Scientific153386652 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates
Diamond Scribing PenRS394-217
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI)Sigma-AldrichSML1627
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge TubesFisher Scientific00301233010.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures
Ethanol Absolute 99.8+%Fisher Scientific1043734170% ethanol is sufficient for cleaning purposes
Fisherbrand ZX4 IR Vortex MixerFisherbrand13284769
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in lengthCM Scientific2540-50
Mineral oilSigma-Aldrich69794
Mini Centrifuge, 230 VPRISM(TM)Z763128
NaClSigma-AldrichS3014
NanoDrop One SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations
OligonucleotidesIntegrated DNA TechnologiesCustomOligonucleotide sequences are unique to the C-star design required.
ScriptGuard RNase inhibitorCELLSCRIPTC-SRI6310KRNase inhibitor
T7-FlashScribe Transcription KitCambioC-ASF3507
Tris-EDTA buffer, 100x stock solutionSigma-Aldrich574793
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterInvitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 WipersVWR21914-758

References

  1. Buddingh', B. C., Hest, J. C. M. v. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).
  2. Fanalista, F., et al. Shape and size contro....

Explore More Articles

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved