A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Представлен протокол получения синтетических биомолекулярных конденсатов, состоящих из нанозвезд амфифильной ДНК, начиная с входящих в их состав ДНК-олигонуклеотидов. Конденсаты производятся либо из одного нанозвездного компонента, либо из двух компонентов и модифицируются для поддержания транскрипции РНК in vitro из встроенной матрицы ДНК.
Синтетические капли и конденсаты становятся все более распространенными компонентами передовых биомиметических систем и синтетических клеток, где они могут быть использованы для создания компартментализации и поддержания жизненных реакций. Синтетические наноструктуры ДНК продемонстрировали значительный потенциал в качестве строительных блоков, образующих конденсат, благодаря своей программируемой форме, химической функционализации и способности к самосборке. Недавно мы продемонстрировали, что амфифильные ДНК-нанозвезды, полученные путем мечения ДНК-соединений гидрофобными фрагментами, представляют собой особенно надежное и универсальное решение. Полученные конденсаты амфифильной ДНК могут быть запрограммированы на отображение сложных, многокомпонентных внутренних архитектур, структурно реагировать на различные внешние стимулы, синтезировать макромолекулы, захватывать и высвобождать полезную нагрузку, подвергаться морфологическим трансформациям и взаимодействовать с живыми клетками. В данной работе мы демонстрируем протоколы получения конденсатов амфифильных ДНК, начиная с входящих в состав ДНК олигонуклеотидов. Мы рассмотрим (i) однокомпонентные системы, образующие однородные конденсаты, (ii) двухкомпонентные системы, образующие конденсаты ядро-оболочка, и (iii) системы, в которых конденсаты модифицируются для поддержки транскрипции наноструктур РНК in vitro .
Синтетические клетки представляют собой устройства микрометрового масштаба (10-50 мкм), сконструированные снизу вверх для воспроизведения функций и структур существующих биологических клеток 1,2. Синтетические клетки часто связаны мембранами, состоящими из липидных двухслойных везикул 3,4,5,6,7, полимерсом 8,9 или протеиносом10,11, ко....
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол разделен на три раздела. В разделе 1 описаны предварительные этапы, включая получение олигонуклеотидов ДНК и стеклянных капилляров. В разделе 2 описывается приготовление конденсатов типа С-звезда различных конструкций, в том числе одно- и двухкомпонентных, и их изв?.......
После отжига конденсаты C-звезды могут быть визуализированы непосредственно в капиллярной трубке или после экстракции, чтобы подтвердить их образование. Для всех вариантов конструкции C-звезды следует наблюдать отчетливые сферические или многогранные конденсаты диаметром примерно 10.......
Описанный здесь протокол обеспечивает подход к получению одно- или двухкомпонентных конденсатов из нанозвезд амфифильной ДНК с вариациями конструкции для введения различных ответов в конденсаты. В соответствии с данным протоколом образуются конденсаты в буферном растворе 0,3 М NaCl в TE,.......
LM, LDM и DT выражают признательность Европейскому исследовательскому совету (ERC) за поддержку в рамках Программы исследований и инноваций Horizon 2020 (ERC-STG No 851667 - NANOCELL). LDM выражает признательность за поддержку со стороны исследовательского гранта Королевского общества для научных сотрудников (RGF/R1/180043) и поддержки от исследовательской стипендии Университета Королевского общества (UF160152, URF/R/221009).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm syringe filters | Sigma-Aldrich | SLGVR33RB | |
24 x 60 mm #1.5 Rectangular cover glasses, Menzel Gläser | VWR | 631-0853 | |
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 34683 | |
6 L Ultrasonic Cleaner with Digital Timer and Heat, 230 VAC | Cole-Parmer | WZ-08895-11 | |
Araldite Rapid Adhesive 2 Part Epoxy Glue | RS | ARA-400005 | |
Bio-Rad C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851197 | |
Brand Microcentrifuge Tube 2 mL with Locking Lid | Fisher Scientific | 15338665 | 2 mL microcentrifuge tubes for the extraction of C-star condensates |
Diamond Scribing Pen | RS | 394-217 | |
Difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolidinone (DFHBI) | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 0030123301 | 0.5 mL microcentrifuge tubes for the preparation of C-star mixtures |
Ethanol Absolute 99.8+% | Fisher Scientific | 10437341 | 70% ethanol is sufficient for cleaning purposes |
Fisherbrand ZX4 IR Vortex Mixer | Fisherbrand | 13284769 | |
Hellmanex III | Hellma | 9-307-011-4-507 | |
Hollow Rectangle Capillaries ID 0.40 x 4.00 mm, 50 mm in length | CM Scientific | 2540-50 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | 69794 | |
Mini Centrifuge, 230 V | PRISM(TM) | Z763128 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
NanoDrop One Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | Used to measure absorbance of oligonucleotides for concentration calculations |
Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Custom | Oligonucleotide sequences are unique to the C-star design required. |
ScriptGuard RNase inhibitor | CELLSCRIPT | C-SRI6310K | RNase inhibitor |
T7-FlashScribe Transcription Kit | Cambio | C-ASF3507 | |
Tris-EDTA buffer, 100x stock solution | Sigma-Aldrich | 574793 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Invitrogen | 10977035 | |
VWR Spec-Wipe 3 Wipers | VWR | 21914-758 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved