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Summary

Il protocollo qui fornito descrive i passaggi dettagliati per eseguire studi di efficacia dei farmaci in un modello bioluminescente di infezione da Trypanosoma cruzi , con particolare attenzione all'acquisizione, all'analisi e all'interpretazione dei dati. Vengono inoltre fornite procedure di risoluzione dei problemi e controllo qualità per ridurre al minimo i problemi tecnici.

Abstract

Per controllare e ridurre l'impatto sulla salute pubblica delle malattie dei protozoi umani come la malattia di Chagas, la leishmaniosi e la tripanosomiasi africana umana, è necessario accelerare lo sviluppo di nuovi farmaci e vaccini. Tuttavia, questo processo è pieno di difficoltà come la biologia dei parassiti altamente complessa e la patogenesi delle malattie e, come tipico per le malattie tropicali trascurate, finanziamenti relativamente limitati per la ricerca e lo sviluppo. Pertanto, i modelli di studio in vitro e in vivo in grado di riprodurre in modo sufficiente le caratteristiche chiave dell'infezione e della malattia, fornendo al contempo un uso razionale delle risorse, sono essenziali per far progredire la ricerca per queste condizioni. Un esempio è il modello murino di imaging a bioluminescenza (BLI) in vivo per la malattia di Chagas, che fornisce un rilevamento altamente sensibile della luce a lunga lunghezza d'onda generata dai parassiti Trypanosoma cruzi che esprimono luciferasi. Nonostante questa tecnica sia diventata l'approccio standard per gli studi in vivo sull'efficacia dei farmaci, i gruppi di ricerca potrebbero ancora avere difficoltà ad implementarla a causa della mancanza di un'adeguata formazione pratica sulla gestione delle apparecchiature e sull'applicazione delle procedure di controllo della qualità, anche quando sono prontamente disponibili apparecchiature BLI adeguate. Considerando questo scenario, questo protocollo mira a guidare dalla pianificazione degli esperimenti all'acquisizione e all'analisi dei dati, con dettagli che facilitano l'implementazione di protocolli in gruppi di ricerca con poca o nessuna esperienza con BLI, sia per la malattia di Chagas che per altri modelli murini di malattie infettive.

Introduction

La malattia di Chagas è endemica in America Latina e colpisce circa sette milioni di persone in tutto il mondo1. Ogni anno, più di 50.000 decessi e perdite economiche di circa 7 miliardi di dollari derivano dalla natura invalidante di questa malattia2. La malattia di Chagas è causata dal protozoo Trypanosoma cruzi, un parassita emoflagellato eterossonico in grado di infettare i mammiferi (selvatici e domestici) e i vettori di triatomine (Hemiptera, Reduviidae)3 nelle Americhe, dove è stabilita la trasmissione vettoriale. Altre importanti vie di infezione includono la trasfusione di sangue, il trapianto di organi, la trasmissione orale (mediante l'ingestione di cibo contaminato da una triatomina infetta)4 e la trasmissione congenita. Le vie di trasmissione non vettoriali hanno contribuito alla diffusione della malattia di Chagas in aree non endemiche 3,5.

La malattia di Chagas si manifesta in due fasi cliniche. La fase acuta è, nella maggior parte dei casi, asintomatica. Le infezioni sintomatiche sono solitamente associate a segni aspecifici come febbre, affaticamento, mialgia, linfoadenopatia, splenomegalia ed epatomegalia. La fase acuta è spesso associata anche a parassitemia pervietà e circolazione sistemica dei parassiti. La morte può verificarsi fino al 10% dei casi diagnosticati, soprattutto in quelli di infezione orale6. La fase cronica è spesso caratterizzata da un lungo periodo di assenza di qualsiasi sintomo. Con il tempo, circa un terzo dei pazienti infettati decenni prima presenta manifestazioni cardiache, solitamente accompagnate da fibrosi e infiammazione miocardica, e/o disturbi gastrointestinali per lo più correlati allo sviluppo di sindromi megaesofaghe e/o megacolon 3,5,6.

Il trattamento eziologico della malattia di Chagas consiste in due soli farmaci: benznidazolo e nifurtimox. Questi agenti antiparassitari sono disponibili da oltre 50 anni e hanno una notevole tossicità e un'efficacia limitata 5,7,8. Di conseguenza, c'è un urgente bisogno di sviluppare trattamenti nuovi, sicuri e più efficaci per i pazienti affetti dalla malattia di Chagas.

Tecniche più sofisticate e accurate permettono ora di ottenere risposte a vecchie domande che permettono di avanzare nella ricerca di nuovi trattamenti per la malattia di Chagas. In questo senso, la comunità scientifica trae grande beneficio dai parassiti geneticamente modificati per studi in vivo sul decorso dell'infezione e valutazione dell'efficacia dei farmaci 9,10,11,12. Un saggio longitudinale basato sul sistema di imaging a bioluminescenza (BLI) consente di valutare l'efficacia durante e dopo il regime di trattamento, portando all'identificazione di composti con attività tripanocida10,13. Il metodo BLI fornisce una misurazione diretta della carica parassitaria, sia in circolo che nei tessuti e negli organi, attraverso la quantificazione della luce prodotta dal lignaggio geneticamente modificato T. cruzi CL Brener Luc::Neon11, che esprime costitutivamente la luciferasi12 della lucciola spostata verso il rosso.

Ciononostante, quasi 10 anni dopo l'istituzione del modello animale BLI della malattia di Chagas e degli studi sull'efficacia dei farmaci, solo pochi gruppi di ricerca dominano questa tecnica. Questo fatto è dovuto non solo al ridotto accesso ad apparecchiature di imaging adeguate, ma anche alla mancanza di formazione e disponibilità di protocolli strutturati e dettagliati. Questo metodo presenta diversi vantaggi rispetto ad altri approcci, che si basano sulla valutazione della parassitemia mediante microscopia, sierologia o valutazione delle infezioni di organi/tessuti mediante qPCR per il rilevamento del DNA del parassita, in quanto consente di migliorare il benessere dei topi e ridurre l'uso di animali grazie alla possibilità di generare dati più robusti e integrati in vivo. Inoltre, questo metodo è, probabilmente, più sensibile, in quanto consente di rilevare prontamente i focolai di parassiti negli organi viscerali dopo il trattamento farmacologico10,12. Pertanto, questo protocollo mira a guidare i gruppi di ricerca sulla parassitologia e altre malattie infettive a stabilire questa metodologia nei loro laboratori, dettagliando le procedure tecniche. In questo articolo, condividiamo l'esperienza ottenuta attraverso l'implementazione del modello BLI della malattia di Chagas in Brasile, il primo del suo genere in America Latina, nell'ambito degli sforzi di scoperta di farmaci coordinati dall'iniziativa Drugs for Neglected Diseases (DNDi).

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state presentate, approvate e condotte secondo le linee guida14 predefinite dal Comitato di Etica Animale dell'Instituto de Ciências Biomédicas dell'Universidade de São Paulo: protocollo CEUA ICB/USP n. 5787250522.

1. Soluzioni

NOTA: Considerare il volume somministrato preconizzato di 10 mL/kg (200 μL per un topo di 20 g di peso)15,16. Ad esempio, preparare una soluzione di lavoro da 15 mg/mL per raggiungere un dosaggio di 150 mg/kg per animali.

  1. Veicolo a sospensione di idrossipropilmetilcellulosa (HPMC-SV)
    NOTA: I reagenti richiesti sono 0,5% (p/v) di idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), 0,4% (v/v) di Tween 80 e 0,5% (v/v) di alcol benzilico.
    1. Per 200 mL di soluzione per veicoli, pesare 1 g di HPMC e sciogliere in 64 mL di acqua ultrapura calda. Mescolate per 2 min.
    2. Aggiungere 120 ml di acqua ultrapura ghiacciata e mescolare per 1 ora. Aggiungere 1 ml di alcol benzilico.
    3. Quindi aggiungere 0,8 mL di Tween 80 utilizzando la tecnica del pipettaggio inverso e continuare ad agitare fino a quando la soluzione non diventa trasparente.
    4. Regolare la soluzione per il volume finale di 200 mL. Conservare l'HPMC-SV in frigorifero (4 °C) per un massimo di 3 mesi.
  2. Benznidazolo
    1. Calcolare la quantità necessaria di soluzione composta, come segue:
      Volume della soluzione composta = (numero di dosi in ogni giorno x numero di giorni x numero di topi da trattare x volume somministrato in ogni topo) + 30% in più.
    2. Pesare la quantità necessaria di benznidazolo (BZ), considerando la dose desiderata. Per il trattamento curativo, una dose orale di 100 mg/kg una volta al giorno per 10 giorni consente di ottenere una guarigione del 100% nel modello cronico di MC17.
    3. Considerando il volume finale desiderato, calcolare la quantità corretta per raggiungere una concentrazione del 5% (v/v) di DMSO e sciogliere completamente BZ in DMSO pulito.
    4. Aggiungere il volume corretto del veicolo in un tubo di vetro per raggiungere una concentrazione del 95% (v/v) di HPMC-SV. Trasferire il BZ disciolto in DMSO nella provetta di vetro contenente HPMC-SV. Omogeneizzare energicamente la sospensione e conservarla a 4 °C.
      Es.: Volume finale della formulazione BZ = 10 mL (passaggio 1.2.1)
      Quantità di BZ = 100 mg (passaggio 1.2.2)
      5% DMSO = 0,5 mL (fase 1.2.3) e 95% HPMC-SV = 9,5 mL (fase 1.2.4)
    5. Prima di ogni somministrazione di farmaco, le formulazioni vengono poste in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 5 minuti a 37 °C e omogeneizzate vigorosamente prima del dosaggio sull'animale.
  3. Ciclofosfamide
    1. Sciogliere la quantità necessaria di ciclofosfamide in acqua ultrapura per ottenere una soluzione di 12,5 mg/mL.
    2. Sterilizzare la soluzione per filtrazione e conservare a 4 °C.
  4. Macchia di Giemsa
    1. Sciogliere 0,6 mg di reagente in polvere di Giemsa in 50 ml di metanolo. Aggiungere 25 ml di glicerolo e mescolare. Rimuovere i precipitati utilizzando carta da filtro e un imbuto. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente (RT), al riparo dalla luce.
    2. Preparare una soluzione di lavoro diluendo 10 mL di soluzione di Giemsa in 90 mL di tampone fosfato misto (20,5 M Na2HPO4, 65,4 M KH2PO4 a pH 7,2).

2. Cultura del Trypanosoma cruzi

  1. Lavorando in una cabina di sicurezza biologica (BSC), coltivare 4 x 106 epimastigoti/mL di T. cruzi CL Brener Luc::Neon11 in terreno LIT (68,44 mM NaCl, 5,36 mM KCl, 112,7 mM Na2HPO4, 5 g/L di triptone, 5 g/L di brodo per infusione di fegato, 0,03 M di emina, 4,16 mM di glucosio), integrato con il 10% (v/v) di siero fetale bovino (FBS), 100 μg/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 150 μg/mL di igromicina come farmaco selettivo a 28 °C. I parassiti in genere raggiungono una fase stazionaria in 3-4 giorni.
  2. Indurre la metaciclogenesi per ottenere parassiti infettivi incubando 3 x 108 epimastigoti in 10 mL di terreno Grace's Insect con il 10% (v/v) di FBS in provette coniche da 15 mL a 28 °C per 7-10 giorni.
  3. Valutare il tasso di differenziazione mediante strisci di colorazione Giemsa. Per questo, spalmare 20 μL di parassiti differenziati in un vetrino e lasciare asciugare per 10 minuti.
  4. In cappa aspirante, procedere con il fissaggio del campione coprendo il vetrino con metanolo pulito e lasciare asciugare completamente (1-2 min). Coprire il vetrino con la soluzione di lavoro Giemsa per 20 min.
  5. Lavare delicatamente il vetrino con acqua distillata. Al microscopio, contare la percentuale di tripomastigoti metaciclici. Se si raggiunge un tasso di differenziazione di almeno il 10%, procedere al passaggio successivo.
  6. Centrifugare i parassiti (120 x g per 10 min) e risospendere il pellet con 10 mL di DPBS. Centrifugare ancora una volta e risospendere i parassiti in 5 mL di DMEM integrati con il 10% (v/v) di FBS, 100 μg/mL di penicillina e 100 U/mL di streptomicina.
  7. In un pallone di coltura da 25 cm2 , eseguire l'infezione di 1,66 x 105 cellule LLC-MK2 (cellule epiteliali renali da Macaca mulatta) a 37 °C in 5% di CO2, in un'incubatrice umidificata18.
  8. I tripomastigoti per colture tissutali (TCT) vengono rilasciati nel terreno dopo 8-9 giorni. Infettare i monostrati di cellule LLC-MK2 fresche con TCT a una molteplicità di infezione (MOI) di 1:40.

3. Analisi dell'omogeneità della popolazione di Trypanosoma cruzi mediante citometro a flusso

  1. Raccogliere i TCT dei ceppi di tipo selvatico CL Brener Luc::Neon e CL Brener, centrifugare a 120 x g per 10 minuti e risospendere i TCT in DPBS. Regolare la densità del parassita per ottenere 1 x 106/mL.
  2. Procedere con l'analisi di popolazione mediante citometro a flusso basato sulla fluorescenza mNeonGreen (es. 506/em. 517 nm)19, acquisendo almeno 20.000 eventi per ogni campione.
    NOTA: La percentuale di popolazione fluorescente si ottiene confrontando il tipo selvatico con il parassita trasfettato. Per procedere con l'infezione dei topi, dovrebbe essere raggiunto almeno il 95% della popolazione di parassiti fluorescenti del lignaggio CL Brener Luc::Neon (Figura supplementare 1).

4. Infezione sperimentale dei topi

NOTA: Per aumentare la quantità di parassiti, i tripomastigoti del flusso sanguigno (BT) sono spesso ottenuti da topi immunodeficienti 10,13. Qui, l'immunosoppressione chimica dei topi BALB/C viene utilizzata per ottenere BT. Per questo, l'immunosoppressione lieve si ottiene con quattro iniezioni intraperitoneali di ciclofosfamide (CTX) a 62,5 mg/kg con intervalli di 96 ore, che viene eseguita in concomitanza con l'infezione da T. cruzi.

  1. Somministrare 62,5 mg/kg di ciclofosfamide sterile mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) 1 giorno prima dell'infezione da T. cruzi .
  2. Infettare ogni topo con 1 x 104 TCT in 0,2 ml di DPBS attraverso la via intraperitoneale. Attenzione all'alto rischio di incidenti durante la manipolazione di agenti patogeni e aghi. Eseguire l'infezione in una BSC, indossando guanti e una visiera durante l'intera procedura.
  3. Monitorare quotidianamente la parassitemia mediante osservazione diretta della BT nel sangue (metodo Pizzi-Brener)20. Al picco della parassitemia, circa 13-17 giorni dopo l'infezione (dpi), effettuare il prelievo di sangue. Per questo, anestetizzare i topi con 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina.
  4. Quando i topi sono completamente anestetizzati21, procedere con la puntura cardiaca utilizzando una siringa da 1 ml collegata a un ago da 24 G X3/4 contenente 50 μL di citrato di sodio al 3,8% (p/v). Scollegare l'ago e inserire delicatamente il sangue in una provetta da centrifuga.
  5. In una BSC, eseguire una diluizione di un'aliquota di sangue nel tampone di lisi ammonio-cloruro-potassio (ACK) e contare i parassiti nella camera di Neubauer. Ripeti questa procedura almeno due volte, poiché piccoli coaguli di sangue influenzano la conta dei parassiti.
    NOTA: Per evitare errori di conteggio, regolare il fattore di diluizione in modo da evitare conteggi inferiori a 30 e superiori a 300 tripomastigoti nella camera Neubauer.
  6. Regolare la densità del parassita a 5 x 103 BT/mL mescolando la quantità necessaria di sangue puro in DPBS.
  7. Infettare topi BALB/c non immunosoppressi con 1 x 103 BT in 0,2 mL di DPBS per topo (5 x 103 BT/mL) per via intraperitoneale utilizzando un ago da 26 G (aghi più stretti portano alla lisi parassitaria)22. Dopo aver iniettato il volume per via intraperitoneale, tenere l'ago all'interno del mouse per 5 secondi per evitare il riflusso.
  8. Metti temporaneamente i topi infetti in una scatola con un tovagliolo di carta per identificare potenziali perdite o sanguinamenti e poi rimetti i topi nelle loro gabbie.

5. Imaging in vivo

NOTA: Il glossario dei termini qui utilizzati è il seguente:

Sessione di imaging: Acquisizione della bioluminescenza eseguita in tutti i gruppi di un determinato esperimento in un dato giorno. La Figura 1A mostra una panoramica della procedura.

Ciclo di imaging: procedura eseguita in sottogruppi di tre topi, dall'iniezione di D-luciferina al recupero in anestesia. Si raccomanda che ogni gruppo sperimentale contenga 6 topi, a causa della variabilità intrinseca del carico parassitario dei topi e di altri fattori che influenzano la quantificazione del BLI descritta di seguito.

Acquisizione di immagini: Ripresa fotografica eseguita dall'apparecchiatura di imaging per quantificare la bioluminescenza, che si traduce in una sovrapposizione di immagini di una fotografia e la bioluminescenza quantificata mostrata come una scala di pseudocolori.

Procedura di imaging: Tutti i passaggi discussi in questa sessione del protocollo.

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Figura 1: Acquisizione dei dati BLI. (A) Diagramma del flusso di lavoro di acquisizione applicato per gli studi sulle malattie infettive, utilizzando come esempio il modello murino bioluminescente della malattia di Chagas. I topi infettati da T. cruzi geneticamente modificati vengono analizzati mediante imaging in vivo sui punti temporali stabiliti. Ad ogni ciclo di imaging, a gruppi di un massimo di tre topi vengono iniettati 150 mg/kg di substrato enzimatico (D-luciferina). Dopo 5 minuti, l'anestesia viene somministrata al 2,5% (v/v) di isoflurano in ossigeno. Quando sono completamente immobili, i topi vengono inseriti in un sistema di imaging e l'acquisizione viene avviata seguendo le impostazioni definite. Dopo l'imaging, i topi si riprendono dall'anestesia e vengono riportati nelle gabbie. Le domande e i problemi frequenti che i ricercatori potrebbero avere e affrontare durante l'acquisizione sono evidenziati in rosso. Questo schema è stato modificato da Lewis et al. (2014)12 (creato con BioRender.com: UD26KWEVS2). (B) Cinetica in vivo della D-luciferina/luciferasi della lucciola spostata verso il rosso (PpyRE9h). I topi al picco di parassitemia di T. cruzi (n = 3) sono stati anestetizzati e iniettati con 150 mg/kg di D-luciferina. Le immagini sono state acquisite per 1 ora (tempo di esposizione: 2 min; binning: 4). In alto: quantificazione del flusso totale ventrale (p/s) (asse Y sinistro, in rosso) e come percentuale della misurazione media più alta (asse Y destro, in blu). I dati sono mostrati come media (curve) e deviazione standard (area ombreggiata). In basso: immagini acquisite del primo (4 min), del segnale BLI più alto (30 min) e dell'ultimo (62 min) punto temporale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Controllare la barra verde nella finestra di acquisizione per verificare se la telecamera del dispositivo ad accoppiamento di carica (CCD) è fredda (-90 °C). Fare clic sulla barra (verde o rossa) per visualizzare la temperatura.
    NOTA: Secondo il manuale dell'apparecchiatura di imaging, l'apparecchiatura di imaging e il software devono essere sempre accesi per mantenere freddo il CCD.
  2. Verificare se è stata eseguita la regolazione automatica dello sfondo. Per farlo, clicca su Acquisizione > Sfondo > Visualizza Dark Charge disponibile. Apparirà un elenco con diverse combinazioni di impostazioni.
    NOTA: Questa procedura riduce il rumore di luminescenza. Se la configurazione scelta risulta in un valore superiore a 1000, in base alla formula "tempo di esposizione x (binning²)", allora la carica al buio non deve essere ignorata. A seconda delle configurazioni software, il binning può essere visualizzato come un numero (fattore di binning) o un intervallo da "piccolo" a "grande". La corrispondenza tra l'intervallo e il fattore di binning è riportata nel manuale del dispositivo.
  3. Se la finestra delle attività (area bianca nella parte inferiore del software) non viene visualizzata, abilitarla nella visualizzazione menu > nella finestra delle attività.
  4. Impostare l'area di imaging facendo clic su Finestra di acquisizione > Campo visivo. L'opzione C (13,2 cm) acquisisce 3 topi e l'opzione D (22 cm) acquisisce 5 topi.
  5. Seleziona l'opzione di salvataggio automatico facendo clic su Acquisizione > Salvataggio automatico e seleziona o crea una nuova cartella per ogni punto temporale.
  6. Stendere un foglio di carta nera opaca sull'area di imaging e posizionare i vetrini di partizione perpendicolarmente tra gli ingressi. Se il produttore non ha fornito le diapositive, utilizzare pezzi (3 cm x 15 cm) di carta nera opaca.
  7. Regolare l'area interna della camera di imaging per accogliere i coni nasali in vetro agli ingressi dell'anestesia. Utilizzare piccoli pezzi di nastro isolante nero per fissare il sistema di anestesia alla piattaforma (al di fuori dell'area dell'immagine).
    NOTA: In alcune versioni dei dispositivi di imaging, un laser definisce l'area di imaging. Se questo strumento non è disponibile, acquisire immagini tramite il software per controllare i vetrini di partizionamento all'interno dell'area di imaging.
  8. Impostare il vaporizzatore di isoflurano al 2,5% (v/v) di ossigeno per le camere di imaging e di induzione. Controllare con il manometro se il gas scorre attraverso il sistema21.
    NOTA: Se il dispositivo di imaging non dispone di un sistema di anestesia per inalazione collegato, sono possibili altre opzioni di anestesia, come la xilazina iniettabile e la ketamina23. In questo caso, il recupero dei topi è lento e il rischio di morte è alto24.
  9. Riempi le siringhe (aghi da 31 G) con D-luciferina (un protocollo completo per preparare la D-luciferina è fornito da diversi fornitori)25,26, proteggile dalla luce diretta e prepara alcuni contenitori di plastica o gabbie extra coprendo l'interno con un tovagliolo di carta.
  10. Tieni un orologio/orologio nelle vicinanze per tenere facilmente traccia del tempo e un quaderno di laboratorio per registrare gruppi di topi, tempo di iniezione di luciferina e qualsiasi altra informazione durante la procedura.
  11. Pesa tutti i topi e registra il loro peso. Segna ogni topo con un pennarello o un tatuaggio sulla coda. Mantieni ben visibile l'identificazione dei topi durante l'intero esperimento. Questo passaggio può essere eseguito anche il giorno prima dell'acquisizione.
    NOTA: Il segno non deve occupare un'ampia area del corpo perché l'inchiostro potrebbe interferire con il segnale bioluminescente. Anche i pennarelli indelebili di diversi colori possono aiutare a differenziare i gruppi.
  12. Per avviare la sessione di imaging, registrare un'immagine luminescente di sfondo (impostazioni: Tempo di esposizione: 5 min; Binning: 'grande' o '16', f/stop: 1) della camera di imaging senza topi. Questa procedura aiuta a identificare le sorgenti luminose luminescenti automatiche o i problemi indesiderati sull'apparecchiatura.
    NOTA: Poiché il BLI si basa sulla reazione enzimatica, il tempo è una caratteristica essenziale dell'esperimento. Controllare tutti gli elementi sopra elencati e le impostazioni dell'attrezzatura prima di iniziare la movimentazione degli animali.
  13. Iniettare 150 mg/kg (i.p.) di D-luciferina nei primi 3 topi senza raggiungere gli organi interni. Metti i topi nella scatola del contenitore per valutare se la D-luciferina perde (soluzione giallo brillante). Prendi appunti se ciò accade e registra il gruppo di topi e il tempo di iniezione della D-luciferina.
  14. Attendere 5 minuti, quindi trasferire i topi nella camera di induzione dell'anestesia. Accendere il sistema. Ci vogliono circa 3 minuti perché i topi siano completamente anestetizzati (assenza di risposte come tremare le gambe, la coda, ecc.) 21.
  15. Aprire lo sportello del dispositivo di imaging, attivare il flusso di anestesia verso la camera di imaging e, allo stesso tempo, spegnere la camera di induzione.
  16. Posiziona ogni mouse nella posizione dei coni del naso: dal mouse 1-3, da sinistra a destra. Accomodare delicatamente i topi con il lato ventrale rivolto verso l'alto all'interno dell'area di imaging mostrata dal laser. Durante l'alloggio, verifica l'ID e la posizione dei topi. Non forzare l'ingresso di topi parzialmente anestetizzati nei coni nasali.
  17. Posizionare i vetrini di partizione tra i mouse e chiudere lo sportello dell'apparecchiatura di imaging.
  18. Regolare le impostazioni di acquisizione nella finestra di acquisizione del software, come segue:
    1. Per i topi non infetti, tempo di esposizione = 5 min / Binning = 'grande' o '16'
      (insieme di configurazioni matematicamente più sensibili per impostare i valori di soglia).
    2. Per i topi infetti nel modello acuto: Tempo di esposizione = 2 min/ Binning = 'medio' o '4'.
    3. Per i topi infetti nel modello cronico: Tempo di esposizione = 5 min/ Binning = 'grande' o '16'.
  19. Verificare se il tempo di iniezione della D-luciferina è stato eseguito almeno 10 minuti prima di iniziare l'acquisizione. In caso contrario, attendere il periodo necessario per ottenere le immagini durante il picco del segnale della luciferasi (Figura 1B); in caso contrario, fare clic su Acquisisci per iniziare l'acquisizione delle immagini.
  20. La finestra Etichette immagine verrà visualizzata dopo l'avvio dell'imaging. Riempi le caselle con le informazioni appropriate su ciascun gruppo, incluso il tempo di iniezione della luciferina, l'esperimento, l'identificazione dei topi, il punto temporale e qualsiasi altra informazione desiderata che possa aiutare a tenere traccia. Queste informazioni saranno incluse nel file della tabella delle misure.
  21. Verificare se il segnale di avvertimento Immagine satura viene visualizzato al termine dell'acquisizione dell'imaging. Le immagini sature non sono accettabili. In questo caso, ridurre il binning e acquisire una nuova immagine. Prendi appunti da considerare nell'analisi.
  22. Una volta acquisita l'immagine, aprire lo sportello della macchina di imaging e girare i mouse verso la vista dorsale (lato posteriore rivolto verso l'alto). Eseguire nuovamente l'acquisizione ed etichettarla in modo appropriato.
  23. Al termine di questa acquisizione di immagini, spegnere il flusso di anestesia. Rimuovere delicatamente i topi dalla camera di imaging e metterli in un contenitore.
  24. Registra il peso corporeo dei topi mentre osservi il recupero dell'anestesia. Registrare eventuali comportamenti anomali o anomalie corporee riscontrate durante la procedura. Una volta che i topi tornano a muoversi, mettili nelle loro gabbie.
    NOTA: Verificare l'intensità BLI per ogni immagine acquisita. Al termine dell'acquisizione, l'immagine bioluminescente registrata e la fotografia verranno visualizzate sul software con una scala automatica che non deve essere considerata. Impostare la scala definita nell'analisi dei dati (descritta di seguito) nella finestra Tavolozza degli strumenti .

6. Analisi dei dati

NOTA: Il protocollo di cui sopra si basa su un software commerciale di imaging in vivo . Tuttavia, una versione software senza licenza può eseguire l'analisi più elementare. I dettagli del software sono disponibili nella Tabella dei materiali.

  1. Apri i file.
    1. Aprire la cartella che contiene i dati acquisiti da un determinato punto temporale dell'imaging selezionando Menu File > Browser > Selezionare la cartella (Figura 2A - Passaggio 1).
      NOTA: Si aprirà una nuova finestra in formato tabella con tutti i dati acquisiti salvati nel file scelto. Visualizzerà il segno Click Number , che è l'ID immagine fornito automaticamente dal software (numeri di dati e ore), le informazioni fornite dal ricercatore nella finestra Etichette immagine durante l'acquisizione e le impostazioni di acquisizione. Tutti questi dati aiutano a ordinare le immagini che possono essere utilizzate nell'analisi, dato che le immagini sature non devono essere utilizzate.
    2. Seleziona più righe relative alle immagini scelte, inclusi i controlli non infetti. Annotare l'ID dell'immagine nel quaderno di laboratorio insieme alle informazioni registrate durante la sessione di imaging.
    3. Assembla le immagini selezionate facendo clic su Carica come gruppo. Questa procedura crea una nuova immagine della sequenza. Pertanto, è possibile regolare le funzioni per tutte le immagini contemporaneamente. Salvare la nuova immagine della sequenza in una nuova cartella diversa da quella utilizzata nel passaggio 6.1 per facilitare la rianalisi dei dati grezzi, se necessario.
    4. Nell'immagine della sequenza, identificare il binning utilizzato per ogni immagine facendo clic su Opzioni > Visualizza > Seleziona fattore di binning (Figura 2A - Passaggio 2). Il fattore di binning acquisito verrà visualizzato nella parte superiore di ogni immagine della sequenza.
    5. Correggere tutti i fattori di binning con lo stesso numero. Per fare ciò, fare doppio clic sull'immagine da regolare. Nella finestra Tavolozza degli strumenti > sezione Regolazione immagine , scegliere il fattore di binning appropriato (Figura 2A - Passaggio 3) - vedere il passaggio 5.18 per la scelta del fattore di binning. Eseguire questa procedura in tutte le immagini divergenti.
      NOTA: Questa procedura influenza direttamente la quantificazione BLI (Tabella 1) ed è ulteriormente trattata nella sezione Discussione.
  2. Imposta la scala.
    1. Distinguere il segnale bioluminescente valido (superiore a 600 conteggi secondo il manuale del dispositivo) in base al controllo non infetto. Per questo, fai doppio clic sull'immagine dei topi non infetti. Quindi, nell'angolo in alto a sinistra della nuova finestra, seleziona l'opzione Conteggi nel campo Unità . Quindi, regolare la scala dei colori per il valore minimo di 600. L'immagine risultante sarà la linea di base per impostare la scala minima di radianza.
    2. Con la finestra della sequenza attiva, selezionare l'opzione Radianza nel campo Unità . Regolare la scala dei colori e la tabella dei colori nella tavolozza degli strumenti. Per questo, disabilita la casella Individuale nell'area Limiti scala colori.
    3. Segnare le caselle Scala logaritmica e Manuale (Figura 2A - Passaggio 4). Impostare i numeri minimi di scala in base al controllo non infetto (come osservato al punto 6.8) e l'area con il segnale più alto come massima (come mostrato nella Figura 2A dalle frecce).
      NOTA: La misurazione della luce 2D in vivo è una quantificazione relativa. È possibile trovare valori di scala diversi a causa delle differenze nella versione e nella calibrazione di ciascun dispositivo. Pertanto, i valori dimostrati nei risultati rappresentativi non potrebbero adattarsi ad altri esperimenti eseguiti su altri dispositivi e tuttavia essere ugualmente validi secondo i controlli interni (non infetti e infetti non trattati).
    4. Dopo aver impostato la stessa scala per tutte le immagini, fare doppio clic su ciascuna immagine, ingrandire la finestra ed esportare la visualizzazione dell'immagine in un formato immagine (.jpg, .tiff, ecc.) utilizzando il pulsante Esporta grafica , denominando i file per treatment_miceID_time punto. (Figura 2A - Passaggio 5). Eseguire questa procedura per tutte le immagini.
  3. Eseguire le misurazioni.
    1. Scegli un'immagine dalla sequenza e fai doppio clic su di essa. Nella sezione Strumenti della finestra Tavolozza degli strumenti > ROI , fare clic sul pulsante Quadrato (Figura 2B - Passaggio 1) e disegnare un rettangolo che copra l'intero mouse.
    2. Fare clic sul bordo della ROI creata e copiare e incollare la stessa ROI per ogni mouse (risultando in tre ROI nell'immagine). Salva le ROI facendo clic su Salva nella sezione Strumenti ROI. Applica le ROI salvate per tutte le immagini selezionando la casella Applica alla sequenza, quindi fai clic su Carica. I ROI salvati verranno utilizzati per tutti i topi dell'intero esperimento.
    3. Regola la posizione ROI in ciascun mouse per adattarla meglio all'animale nell'area di misurazione. Quando tutti i mouse sono etichettati, fare clic sul pulsante Misura ROI (Figura 2B - Passaggio 2). Apparirà la tabella delle misure del ROI . Seleziona i tipi di misurazione: Radianza; Attributi immagine: tutti i valori possibili; ROI Dimensioni: cm. Quindi, fai clic sul pulsante Seleziona tutto , seguito dal pulsante Copia .
    4. Incolla i dati direttamente in un software di analisi delle tabelle (foglio di calcolo). In alternativa, è possibile esportare un file in formato .csv o .txt.
  4. Lavora sui dati.
    1. Nel software di analisi delle tabelle, organizzare i dati per gruppi (trattamento, controllo non infetti, non trattati, ecc.).
    2. La carica di parassiti è mostrata come bioluminescenza di tutto il corpo. Pertanto, organizzare i dati in modo che corrispondano ai valori di flusso totale ventrale e dorsale degli stessi topi e sommarli.
    3. Calcolare la media e la deviazione standard dei valori sommati considerando ciascun gruppo (es: Tabella supplementare 1). Traccia i dati in un software di grafica e statistica.
    4. Prepara un pannello con immagini bioluminescenti in un software di presentazione di immagini o diapositive. Posiziona ogni mouse in una colonna e in ogni punto temporale della riga per costruire una matrice di efficacia del farmaco per facilitare la visualizzazione e l'interpretazione dei dati.
      NOTA: È disponibile un'opzione per integrare le immagini direttamente nel software di imaging senza eseguire il passaggio 6.2.4 (Visualizza > finestra Layout immagine). Tuttavia, l'interfaccia software e gli strumenti limitano l'organizzazione dei dati.

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Figura 2: Fasi dell'analisi dei dati, dall'impostazione delle scale dell'immagine alla quantificazione della luminescenza. (A) Vista del software Living Image per l'elaborazione dei dati delle immagini. Passaggio 1: carica i dati acquisiti come sequenza utilizzando lo strumento Browser. Passaggio 2: identificare il binning utilizzato per ogni acquisizione (apparirà sopra le singole immagini). Passaggio 3: imposta tutte le immagini dei topi infetti sullo stesso fattore di binning e applica il fattore di binning 16 per i topi non infetti. Passaggio 4: imposta manualmente la scala dei colori in base ai topi non infetti (freccia viola), che dovrebbero essere visti sullo schermo come non bioluminescenti, e ai topi infetti e non trattati ai focolai bioluminescenti più alti (freccia rossa), che dovrebbero essere visti come rossi. Passaggio 5: per ottenere un'immagine priva di informazioni scritte, fare doppio clic su ciascuna immagine ed esportare l'immagine utilizzando il pulsante Esporta grafica . (b) Visualizzazione degli strumenti per le regioni di interesse (ROI). Passaggio 1: disegna un ROI che copre interamente un mouse e copia e incolla lo stesso ROI per ogni animale. Salva le ROI corrette e applicale a tutte le immagini dell'esperimento. Passaggio 2: fare clic sul pulsante Misura ROI per generare la tabella da esportare come .csv o .txt. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

7. Procedura ex vivo

  1. Iniettare 150 mg/kg di D-luciferina i.p. nel topo (uno per ciclo ex vivo ) e attendere 3 minuti. Anestetizzare i topi utilizzando 100 mg/kg di ketamina e 10 mg/kg di xilazina i.p.
  2. In una cabina di sicurezza biologica, quando il topo è completamente insensibile al pizzicamento delle zampe, tagliare la pelle del topo per esporre il peritoneo (senza aprire la cavità del peritoneo) e il tessuto dell'ascella sinistra. Procedere con il dissanguamento tagliando l'arteria ascellare e il vaso.
  3. Raccogli il sangue utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta. Quindi perfondere 10 mL di 0,3 mg/mL di D-luciferina in soluzione di DPBS attraverso il ventricolo sinistro del cuore.
  4. Disporre gli organi selezionati in punti prestabiliti su una piastra di Petri e immergerli in una soluzione di d-luciferina 0,3 mg/mL. Questa procedura deve essere eseguita entro un massimo di 30 minuti.
  5. Acquisire l'immagine luminescente degli organi asportati (cuore, polmoni, timo, fegato, muscolo quadricipite, mesentere, milza, rene, ghiandola surrenale, grasso viscerale, esofago, stomaco, intestino tenue, cieco, colon, cervello, grasso sottocutaneo, utero, grasso gonadico, vescica e membrana peritonea) utilizzando 5 minuti di tempo di esposizione e binning 16, a seconda dell'intensità del segnale (le immagini sature non sono accettabili)22.
    NOTA: La stessa procedura deve essere eseguita in un topo non infetto prima di quelli infetti per impostare la soglia.

Representative Results

Utilizzando un adeguato modello murino basato su parassiti transgenici che esprimono costitutivamente la luciferasi, è possibile riprodurre le caratteristiche chiave dell'infezione umana da T. cruzi causando un danno minimo all'ospite, consentendo il monitoraggio in tempo reale dei parassiti mediante BLI di tutto il corpo dell'ospite in modo longitudinale (per tutta la vita), per un massimo di diversi mesi12.

La Figura 3 mostra un esperimento pilota che dimostra l'andamento temporale dell'infezione da CL Brener Luc::Neon dal giorno 1 dopo l'infezione fino a 150 dpi nei topi BALB/c. Nei primi 20 dpi, il carico di parassiti dedotto dalla bioluminescenza aumenta, tipico del picco di parassitemia, seguito da una forte diminuzione del carico di parassiti, a causa del controllo immunitario dei topi. Pertanto, la fase acuta dell'infezione è considerata i primi 50 dpi. La fase cronica è definita quando l'infezione raggiunge un tasso di bioluminescenza costante, da 100 a 150 dpi.

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Figura 3: Informazioni sul modello. Cinetica dell'infezione da Trypanosoma cruzi CL Brener Luc::Neon nei topi BALB/c (n = 11). Pannello superiore: immagini bioluminescenti ventrali e dorsali da diversi punti temporali per 150 giorni dopo l'infezione (dpi) con 1 x 10³ di tripomastigoti nel flusso sanguigno mediante iniezione intraperitoneale. Scala della mappa di calore (in Log10) del segnale bioluminescente in radianza (p/s/cm2/sr). Codice colore: Viola = 5 x 103; rosso = 1 x 107. Pannello inferiore: quantificazione del segnale bioluminescente nel flusso totale (p/s) di topi a corpo intero. I dati sono espressi come medie (linee) e deviazioni standard (regioni ombreggiate). I periodi definiti per le fasi acute e croniche dell'infezione in questo modello murino sono evidenziati in arancione. I valori medi di luminescenza dei topi non infetti (n = 3) sono indicati come soglia (linea grigio chiaro). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli esiti terapeutici possono anche essere previsti poiché le fasi principali dell'infezione sono ben riprodotte in un modello murino. Pertanto, il BLI è ora applicato alla scienza traslazionale attraverso studi proof-of-concept che supportano il processo decisionale sul potenziale di efficacia e progressione del composto nella pipeline di sviluppo10,27. Nel modello murino acuto, il trattamento orale dovrebbe iniziare quando l'infezione raggiunge il picco di parassitemia (circa 14-21 dpi), caratterizzato da un elevato numero di tripomastigoti nel sangue (circa 1 x 105 tripomastigoti/mL - dati non mostrati) e infezione sistemica. Nella fase cronica, il trattamento dei topi inizia a 100 dpi, quando il carico di parassiti è relativamente molto più basso, con parassitemia subpatente stabile.

Per dimostrare l'applicazione del protocollo sopra descritto nella valutazione degli agenti antiparassitari, abbiamo confrontato l'efficacia del trattamento del benznidazolo (BZ), il farmaco standard utilizzato per il trattamento della malattia di Chagas, e del posaconazolo (Posa), un inibitore della sterolo 14α-demetilasi (CYP51) che ha fallito negli studi clinici per la malattia di Chagas, e che si è anche dimostrato inefficace come agente antiparassitario contro T. cruzi in vitro e in vivo, incluso nel modello BLI descritto nel presente protocollo 13,18,28,29,30.

Per il modello murino acuto, coorti di 6 topi per gruppo sono state trattate per via orale con gavage31 per 20 giorni con Posa a 20 mg/kg o BZ a 100 mg/kg, una volta al giorno. I topi sono stati anche trattati con BZ per 5 giorni a 100 mg/kg una volta al giorno per valutare l'effetto di trattamenti brevi. Dopo l'eliminazione del composto (10 giorni dopo la fine del trattamento), i topi BLI-negativi sono stati immunosoppressi, una condizione che promuove la recidiva dell'infezione quando non si ottiene una cura parassitologica (Figura 4A). Il trattamento con Posa ha determinato una riduzione del 99,49% ± dello 0,27% (media ± deviazione standard) del carico di parassiti dedotta dalla bioluminescenza alla fine del trattamento ed è rimasto a livelli simili di topi non infetti durante il periodo di eliminazione del composto farmacologico (ad eccezione del topo #3, con un segnale transitorio a 40 dpi, e del topo #2, che ha dimostrato un punto BLI debole a 44 dpi). Rispetto al gruppo non trattato, il trattamento con BZ per 20 giorni ha ridotto del 100% ± dello 0,01% il carico di parassiti dedotto dalla bioluminescenza alla fine del trattamento. Al contrario, il trattamento breve con BZ per 5 giorni ha portato a una riduzione del 99,98% ± dello 0,03% a 19 dpi (simile al livello soglia). Tuttavia, in questo caso, la riduzione del BLI è stata transitoria e nelle acquisizioni successive, tutti i topi hanno presentato la riattivazione dell'infezione (Figura 4B).

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Figura 4: Disegno dell'esperimento proof-of-concept e risultati ottenuti con l'imaging a bioluminescenza nel modello acuto della malattia di Chagas. (A) Grafico schematico del processo temporale nel modello murino acuto della malattia di Chagas per studi preclinici per la valutazione dell'efficacia del composto. Punti neri: punti temporali di imaging. Pallone dei medicinali e barretta arancione: inizio e fine del trattamento, rispettivamente. Icona della siringa: iniezioni di ciclofosfamide. DPI: Giorno dopo l'infezione. Codice colore: grigio = infezione non trattata; arancione = periodo di trattamento; blu = fase di eliminazione composta; giallo = periodo di immunosoppressione. (B) Decorso temporale del trattamento di Trypanosoma cruzi. Pannello di sinistra: immagini di bioluminescenza ventrale di topi BALB/c (i) non trattati o trattati per 20 giorni con (ii) posaconazolo (Posa) a 20 mg/kg, (iii) benznidazolo (BZ) a 100 mg/kg trattati per 20 giorni e (iv) BZ a 100 mg/kg trattati per 5 giorni con (n = 6/gruppo). Tutti i trattamenti sono stati somministrati per via orale mediante sonda gastrica (10 ml/kg) una volta al giorno. La mappa di calore in scalaLog 10 indica l'intensità del segnale bioluminescente da basso livello (blu) ad alto (rosso). Grafico a destra: quantificazione di tutto il corpo dei dati di imaging a bioluminescenza. I dati sono espressi come medie (linee) e deviazioni standard (regioni ombreggiate). Legenda: Pallone per medicinali: inizio del trattamento (14 dpi); barra arancione: fine del trattamento (18 dpi/33 dpi); iniezioni di ciclofosfamide ICiN (dal giorno 44-53); Orange Dot: topo analizzato con procedura ex vivo ; § dati esclusi a causa di perdite di D-luciferina nelle urine. (C) Procedura ex vivo per la rilevazione di focolai di T. cruzi in organi e tessuti. La chiave di distribuzione della targa è presentata nella parte inferiore della figura (creata con BioRender.com: ZY26LG8AOF). Stessa scala di radianza mostrata nel pannello vivo . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

In questo modello, il trattamento antiparassitario può ridurre il carico di parassiti al di sotto del limite di rilevamento BLI di 1000 parassiti. Pertanto, i topi appaiono come BLI negativi10. Per garantire che sia stata raggiunta una cura parassitologica, è necessario promuovere l'immunosoppressione dei topi utilizzando il trattamento con ciclofosfamide 29,32. I topi che hanno ancora una carica di parassiti non rilevabile dopo il trattamento farmacologico diventeranno BLI-positivi dopo l'immunosoppressione. Questo effetto è dimostrato in modo più esteso dal trattamento con Posa nel modello acuto, che promuove la recidiva del parassita. In questo esperimento, la procedura ex vivo è stata eseguita su topi con il segnale bioluminescente più basso per valutare il tropismo tissutale del parassita (Figura 4C). I topi non trattati mostrano forti segnali bioluminescenti, specialmente nel tratto gastrointestinale (TGI) e nei tessuti associati come il grasso viscerale e il mesentere. Inoltre, la pelle era un sito associato alla persistenza del parassita. I topi trattati con Posa presentavano macchie bioluminescenti a bassa intensità che erano più limitate al colon, al mesentere e al grasso viscerale. D'altra parte, nei topi trattati con un regime di trattamento curativo, come BZ 100 mg/kg per 20 giorni, non viene rilevato alcun segnale bioluminescente anche in immunosoppressione. Pertanto, considerando che dopo aver promosso le condizioni per l'innalzamento del segnale bioluminescente al di sopra del livello di soglia di1000 parassiti 10 e l'aumento della sensibilità esponendo gli organi viscerali, si ritiene che BZ 100 mg/kg per 20 giorni fornisca una cura sterile. La valutazione della cura sterile è stata precedentemente convalidata con diverse tecniche 10,13,17,33,34.

Un disegno di studio simile è stato applicato al modello cronico (Figura 5A), in cui i topi (n = 6/gruppo) hanno iniziato a essere trattati al giorno 100 dopo l'infezione. A questo punto, Posa 20 mg/kg, BZ a 100 mg/kg o 10 mg/kg una volta al giorno sono stati somministrati per via orale per 20 giorni. Dopo il periodo di eliminazione del farmaco, i topi BLI-negativi sono stati immunodepressi. Inoltre, per valutare la cura sterile, i topi che erano ancora BLI-negativi al termine della fase di immunosoppressione sono stati sottoposti ad analisi ex vivo .

Nell'infezione cronica, il trattamento con Posa alla dose di 20 mg/kg ha portato a una diminuzione del 95,03% ± del 6,18% del carico di parassiti dedotto dalla bioluminescenza alla fine del trattamento ed è rimasto a livelli simili di topi non infetti durante il periodo di eliminazione del farmaco. Dopo l'immunosoppressione, la maggior parte dei topi ha mostrato un livello variabile di segnale e distribuzione BLI (Figura 5B). La procedura ex vivo ha rivelato che un topo BLI-negativo per tutto il corpo trattato con Posa presentava una macchia bioluminescente nel colon rilevabile tramite esame ex vivo (Figura 5C).

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Figura 5: Disegno dell'esperimento di valutazione del farmaco e risultati ottenuti nel modello cronico di infezione da Trypanosoma cruzi mediante imaging a bioluminescenza. (A) Grafico schematico del disegno dell'esperimento del modello murino di malattia di Chagas cronica. Punti neri: punti temporali di imaging. Pallone dei medicinali e barretta arancione: inizio e fine del trattamento, rispettivamente. Icona della siringa: iniezioni di ciclofosfamide. Dpi: giorno post-infezione. Codice colore: Grigio = infezione non trattata; arancione = periodo di trattamento; blu = fase di eliminazione composta; giallo = immunosoppressione; lillà = recidiva. (B) Valutazione longitudinale dell'efficacia del trattamento nel modello cronico della malattia di Chagas. Pannello sinistro: BLI ventrale di topi BALB/c (i) non trattati o trattati per 20 giorni con (ii) posaconazolo (Posa) a 20 mg/kg; iii) benznidazolo (BZ) a 100 mg/kg e iv) BZ a 10 mg/kg (n = 6/gruppo). Tutti i trattamenti sono stati somministrati per via orale mediante sonda gastrica una volta al giorno. Grafico a destra: somma dei dati grezzi del flusso totale ventrale e dorsale. Legenda: pallone del medicinale: inizio del trattamento (102 dpi); barra arancione: fine del trattamento (121 dpi); Barra gialla e icona della siringa: iniezioni di ciclofosfamide (dal giorno 131-142). Orange dot: topo analizzato con procedura ex vivo . ! Il topo è morto durante l'anestesia. figure-representative results-13351 Il topo mostra anomalie addominali. La scala della mappa di calore (Log10) indica l'intensità della bioluminescenza nell'unità di radianza da un livello basso (3 × 105 come blu) ad alto (1 × 107 come rosso). (C) Analisi ex vivo del tropismo di T. cruzi nei tessuti. Rilevamento in bioluminescenza di organi asportati da topi immunosoppressi in vivo BLI-negativi dopo trattamento con Posa e BZ a 100 mg/kg o topi con il segnale più basso nei gruppi non trattati e BZ a 10 mg/kg. La chiave di distribuzione della targa è mostrata nella parte inferiore della figura (creata con BioRender.com: ZY26LG8AOF). La scala di radianza è uguale al pannello in vivo . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il trattamento con BZ a 100 mg/kg ha ridotto la bioluminescenza a livelli soglia (93,87% ± 2,14%) a 122 dpi e in avanti fino alla fine dell'esperimento. Considerando l'analisi ex vivo , BZ ha raggiunto un tasso di guarigione del 100% (6/6 topi), poiché nessun topo ha presentato un ritorno del segnale bioluminescente anche quando sono stati esaminati gli organi interni e immunodepressi. Ciò significa mancanza di ricadute. Tuttavia, il regime di trattamento con BZ con una concentrazione più bassa ha portato a una leggera riduzione della bioluminescenza (85,95% ± 18,43%) ma nessuna cura, poiché i topi hanno continuato a mostrare focolai di segnale bioluminescenti rilevabili in tutti i punti temporali successivi. Pertanto, questo modello consente la differenziazione quantitativa tra trattamenti inefficaci (posaconazolo e trattamento subottimale con benznidazolo) e trattamenti efficaci (dosaggio e durata ottimali del trattamento con benznidazolo).

Figura 1 supplementare: Analisi pre-infezione dell'espressione della luciferasi nella popolazione di T. cruzi mediante misurazione del gene reporter mNeonGreen fluorescence. Citometria a flusso della proteina fluorescente mNeonGreen espressa costitutivamente dal parassita CL Brener Luc::Neon. Istogramma normalizzato del numero di parassiti (asse Y) mediante intensità di fluorescenza mNeonGreen (asse X). La legenda interna dimostra il ceppo e la forma analizzati, la mediana della fluorescenza e la percentuale della popolazione di fluorescenza. Le linee di gate sono definite dal ceppo CL Brener wild type (WT) come controllo non fluorescente. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare 1: Esempio di tabella di analisi nella misurazione BLI. Dati grezzi ottenuti dalla quantificazione dell'imaging a bioluminescenza del giorno 19 dopo l'infezione nel modello acuto utilizzato nei risultati rappresentativi mostrati nella Figura 4B. Descrizione gruppi: Controllo come topi non infetti (n = 3/gruppo); veicolo come topi infetti non trattati; posaconazolo (Posa) a 20 mg/kg per 20 giorni; benznidazolo (BZ) a 100 mg/kg per 20 giorni; BZ a 100 mg/kg trattato per 5 giorni (n = 6/gruppo). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

L'imaging a bioluminescenza è un metodo innovativo che consente il rilevamento di un gene referto utilizzando uno spettro visibile e infrarosso di radiazione elettromagnetica. Pertanto, non sono necessari marcatori radiomarcati per tracciare il campione35. BLI è adatto per modelli di roditori e altre piccole specie. È molto utile per gli studi preclinici perché è più sicuro e consente diversi cicli di immagini, causando il minimo disagio all'animale. Inoltre, l'imaging in vivo è molto flessibile grazie alla possibilità di combinare bioluminescenza, fluorescenza e altre tecniche come la tomografia a emissione di positroni36.

L'imaging ottico è governato da proprietà fisiche ottiche, come l'assorbimento e la diffusione. Tutti i tessuti assorbono e diffondono la luce di lunghezze d'onda distinte in modo diverso37. Un passaggio critico è la selezione di un gene reporter senza tenere conto della lunghezza d'onda emessa della luce prodotta dalla reazione chimica. Mentre un livello di espressione genica reporter può essere elevato in vitro nei saggi bioluminescenti, gli stessi livelli di espressione possono non essere raggiunti quando si passa al contesto in vivo. In questo protocollo, abbiamo utilizzato la versione ottimizzata per il codone di Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 per i tripanosomatidi9, che emette luce a 617 nm, una delle più adatte per gli studi in vivo 39. Le lunghezze d'onda più lunghe di 600 nm sono meno assorbite e disperse dai cromofori endogeni del corpo, in particolare l'emoglobina e la melanina. Pertanto, le luci rosse possono essere trasmesse attraverso diversi centimetri di tessuto, consentendo ai fotoni di raggiungere la telecamera CCD anche dall'interno dei tessuti viscerali39,40.

Un'area di preoccupazione nelle impostazioni di imaging è la mancanza di una comprensione completa della loro funzione e dei loro effetti. Il binning, una tecnica di pre-elaborazione, combina le informazioni acquisite dai rilevatori contigui in un pixel più grande. Questo processo migliora il rapporto segnale/rumore, riducendo il rumore di fondo e migliorando la sensibilità. Tuttavia, diminuisce la precisione della risoluzione spaziale, risultando in un'immagine pixelata41,42. Questo compromesso è una considerazione importante nella strategia di imaging.

Sulla base del profilo del prodotto target e del profilo del candidato target per la malattia di Chagas34, lo studio proof-of-concept si concentra sulla sensibilità per rilevare T. cruzi e aiutare a stabilire se un nuovo farmaco candidato può raggiungere una cura sterile (rappresentata dalla mancanza di recidiva dopo diversi cicli di immunosoppressione). Pertanto, eseguiamo il BLI utilizzando il fattore di binning più alto senza sovrasaturare l'immagine. Quando l'immagine è sovrasatura, viene eseguita una nuova acquisizione utilizzando un fattore di binning inferiore. Durante l'analisi, viene applicata una correzione matematica alle immagini che hanno richiesto un binning diverso. In questo modo, i dati finali dovrebbero essere presentati utilizzando lo stesso binning. La tabella 1 mostra i diversi valori ottenuti quando sono stati applicati fattori di binning distintivi nella stessa immagine e ROI.

Tabella 1: Influenza delle impostazioni di binning sulla quantificazione BLI. Quantificazione di tre ROI sull'immagine del modello acuto (d13) e del modello cronico (d118), analizzati in diversi fattori di binning. Clicca qui per scaricare questa tabella.

A causa dell'attuale scenario della malattia di Chagas in clinica, gli sforzi di scoperta di farmaci mirano a eliminare completamente i parassiti (cura parassitologica)27,34. Pertanto, il protocollo preclinico in vivo include approcci che superano i limiti della sensibilità tecnica del BLI. Uno degli approcci consiste nel trattare i topi con ciclofosfamide per ridurre la risposta immunitaria che controlla il carico di parassiti. Un'altra strategia consiste nel ridurre la profondità dei tessuti e rimuovere gli strati di muscoli, pelle e pelo che ostruiscono il percorso della luce verso la fotocamera. Attraverso la procedura ex vivo, è possibile rilevare piccole macchie bioluminescenti, rivelando focolai di parassiti al di sotto della soglia BLI in vivo, come mostrato nella Figura 5C nel risultato ex vivo del topo trattato con Posa.

La progettazione di un esperimento pilota per valutare il modello stesso e le dinamiche dell'infezione è fondamentale per stabilire un esperimento accurato per la valutazione dell'efficacia dei farmaci antiparassitari. Pertanto, il ricercatore sarà in grado di definire in anticipo le impostazioni BLI corrette e il decorso del tempo di infezione. In un esperimento esplorativo, uno strumento che può essere utile per definire le impostazioni di acquisizione è l'"Autoesposizione". Con questo strumento, il ricercatore stabilisce la priorità di tre impostazioni (Tempo di esposizione, Binning e F/Stop) per acquisire la migliore immagine possibile. In particolare, il ricercatore dovrebbe assicurarsi che le immagini siano acquisite all'interno della gamma dinamica della camera CCD, senza sovrasaturazione o sottoesposizione, che possono essere verificate attraverso i limiti minimo e massimo della scala e della funzione di esposizione automatica (Menu Modifica > Preferenze > Scheda Acquisizione > Scheda Esposizione automatica). In questo protocollo, l'apertura della fotocamera è stata impostata al valore massimo (F/Stop: 1) e sono stati definiti diversi tempi di esposizione e fattori di binning per i modelli acuti e cronici. Queste impostazioni offrono la prevedibilità del tempo per eseguire diversi cicli di immagini contemporaneamente. Considerando che il metodo reporter si basa su una reazione enzimatica, sia la biodistribuzione del substrato nel topo che la cinetica della luciferasi influenzano il segnale bioluminescente e, quindi, la quantificazione dell'infezione (Figura 1B). Di conseguenza, l'acquisizione di immagini in diversi momenti della cinetica enzimatica introduce una variabilità dei dati che non può essere considerata o corretta e influisce sul calcolo del flusso totale (fotoni/secondo) o della radianza (fotoni/secondo/cm2/steradiante). Inoltre, l'infezione da T. cruzi mostra un posizionamento spaziale dinamico nei topi (diverse aree e tessuti, profondità e carico di parassiti). Quindi, stabilire un valore di conteggi da acquisire potrebbe perdere le fonti di segnale più deboli (basso numero di parassiti in un determinato punto più profondo del tessuto) se la fonte di un altro segnale più forte soddisfa i criteri di auto-esposizione definiti.

Una caratteristica complessa del software Living Image è la visualizzazione dell'immagine acquisita in una scala di colori automatica. Non è possibile preimpostare la scala per visualizzare automaticamente un'immagine acquisita nuova di zecca in base ai valori della scala selezionati (vedere il passaggio 6.2 del protocollo). Questa situazione costringe il ricercatore a modificare manualmente le immagini una per una ai valori max e min scelti. Di conseguenza, gli utenti non esperti e non ben addestrati non hanno la lettura corretta durante la sessione di acquisizione e potrebbero fuorviare i dati o perdere informazioni importanti in quel momento. Per questo, l'esperimento pilota è vantaggioso.

Una delle domande più comuni sulla progettazione dell'esperimento proof-of-concept è come scegliere la durata e la dose del trattamento. Per le nuove entità chimiche, questi parametri sono solitamente definiti dalla potenza e dalla selettività del composto in vitro, in combinazione con i dati generati dal metabolismo e dalla farmacocinetica dei farmaci (DMPK) e dagli studi di tollerabilità condotti prima dei test in vivo per l'efficacia. In sintesi, dopo aver identificato i composti in grado di uccidere selettivamente il parassita all'interno delle cellule, i primi esperimenti ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione) vengono eseguiti in vitro per stimare, tra gli altri parametri, la solubilità acquosa dei composti, la permeabilità cellulare e la stabilità metabolica. Se i composti mostrano un buon equilibrio di proprietà in vitro (solitamente definite nei profili dei candidati bersaglio), allora questi candidati vengono sottoposti a studi di farmacocinetica (PK) in vivo su topi sani, che delineano l'esposizione del composto nel sangue (e possibilmente anche nei tessuti) e forniscono un'idea generale della tollerabilità a diversi livelli di dose17, 34,43. Idealmente, l'obiettivo della valutazione farmacocinetica nella maggior parte delle malattie infettive è determinare la fattibilità di raggiungere concentrazioni plasmatiche libere (corrette per il legame con le proteine plasmatiche) che sono superiori alle concentrazioni EC50/EC90 44 - la concentrazione efficace che uccide o almeno inibisce la crescita del 50% o del 90% dei parassiti, rispettivamente - per un periodo di tempo sufficientemente lungo. Se si raggiunge un'esposizione sufficiente a un certo livello di dose, questo regime può essere utilizzato durante gli studi di efficacia utilizzando il modello Chagas BLI. Per gli studi di riposizionamento dei farmaci, devono essere disponibili dati farmacocinetici in vitro e in vivo. Un buon inizio per la riprofilazione dei farmaci sono i database chimici come PubChem45, che forniscono dati riconosciuti che possono essere convertiti in topi utilizzando la scala allometrica46 per stimare i regimi di trattamento sicuri e non tossici da testare. Tuttavia, non è sempre così. Gli studi sulla farmacocinetica sono ancora un campo trascurato nella scienza accademica e poche aziende farmaceutiche pubblicano i loro risultati sulla farmacocinetica. La comunità scientifica della scoperta di farmaci raccomanda di includere la valutazione farmacocinetica in vivo insieme ai saggi di efficacia dei farmaci (farmacodinamica)47. Pertanto, l'imaging preclinico è compatibile con le misurazioni dei composti contemporaneamente e questo approccio associato migliora la robustezza dei dati.

Inoltre, la manipolazione, il peso e le condizioni di salute dei topi vengono monitorati durante l'intero esperimento. I segni di tossicità e gli effetti collaterali come curvatura, tremore, perdita di equilibrio, riluttanza a muoversi, riluttanza a mangiare o bere, prostrazione o qualsiasi altra anomalia presente nel gruppo o nelle condizioni individuali del topo devono essere registrati e riportati negli studi preclinici. Uno degli obiettivi dell'imaging ottico è garantire il benessere degli animali. Pertanto, gli endpoint umani dovrebbero essere applicati nei topi con segni di dolore descritti nella scala48 della smorfia. Inoltre, i topi sono stati pesati settimanalmente durante l'acquisizione del BLI e, più spesso, durante il dosaggio del farmaco e il trattamento con CTX. Seguendo le normative sul benessere degli animali, i topi che perdono più del 20% del peso corporeo devono essere immediatamente soppressi in modo umano.

Il modello bioluminescente di T. cruzi è ora il modello sperimentale all'avanguardia per la scoperta e lo sviluppo di nuovi trattamenti per la malattia di Chagas. Un modello che replica le caratteristiche chiave dell'infezione da T. cruzi e della malattia di Chagas49, consentendo il monitoraggio in tempo reale della parassitemia e la differenziazione di composti con vari profili di efficacia associati a modalità d'azione note. Il BLI è una tecnica che migliora l'assertività nell'identificazione dei tessuti infetti. Consente la selezione precisa di tessuti infetti da utilizzare in un'ampia gamma di approcci, inclusi tutti i metodi classici già applicati nella ricerca su T. cruzi 50,51. Inoltre, consente ai ricercatori di esplorare tecnologie all'avanguardia e svilupparne di nuove33. Inoltre, BLI fornisce il miglioramento del benessere animale e un uso più razionale secondo i principi delle 3R10,35, tutto in una volta.

Diversi gruppi di ricerca incentrati sulle malattie tropicali neglette sono collocati in paesi in cui i dispositivi di imaging in vivo non sono disponibili. Per superare lo scenario attuale, nuove reti internazionali come Global BioImaging e i loro consorzi associati promuovono azioni per fornire un accesso aperto alle strutture di base dell'imaging e migliorare la formazione del personale e degli scienziati dell'imaging52,53. Queste iniziative, insieme a protocolli utente amichevoli come questo, possono offrire condizioni di democratizzazione delle tecnologie di fascia alta per tutti i ricercatori. L'implementazione di questo metodo nella scoperta preclinica di farmaci ha offerto una solida lettura dell'efficacia e un valore predittivo dell'esito clinico, facilitando la scoperta di farmaci per la malattia di Chagas.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Amanda Franscisco, John Kelly e Fanny Escudié per aver fornito formazione e supporto sui test di efficacia dei farmaci, John Kelly e Simone Calderano per aver fornito i parassiti e Gabriel Padilla per il supporto con gli studi sugli animali. A.C.S ha ricevuto una borsa di studio CAPES PSDE per la formazione presso la London School of Hygiene and Tropical Medicine (Regno Unito). Gli autori desiderano inoltre ringraziare la piattaforma di ricerca sulla citometria a flusso e l'imaging (FLUIR) presso la Core Facility for Scientific Research - University of Sao Paulo (CEFAP-USP) per il supporto tecnico con l'analisi delle apparecchiature IVIS Spectrum e il Laboratorio di Genetica e Controllo Sanitario ICB-USP per i saggi post-sperimentazione per il controllo di qualità dei topi come privi di patogeni specifici. Questo progetto è stato finanziato da DNDi. DNDi è grata ai suoi donatori, pubblici e privati, che hanno fornito finanziamenti per tutte le attività di DNDi sin dal suo inizio nel 2003. Un elenco completo dei donatori di DNDi è disponibile all'indirizzo https://dndi.org/about/donors/.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BD LSRFortessa™ X-20 Cell AnalyzerBD Biosciences
Weighing Balance (animal facility)Available from several suppliers
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemRevvity (former PerkinElmer)
FlowJ Software v10.7.1BD Biosciences
Living Image Software for Spectrum v4.7.1Revvity (former PerkinElmer)License Free Analysis Software called 'Aura Imaging' could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)
Microsoft Office softwareMicrosoft
GraphPad Prism v8.4.0GraphPad Software Inc.
DMEM Low GlucoseVitrocellD0025
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Foetal Bovine Serum (FBS)Gibco16000-044
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Trypsin 0.5% EDTAGibco25300-062
LIT mediumIn house
Hygromycin B (50 mg/mL)Gibco10687010
Grace′s Insect MediumSigma-Aldrich G9771
HEPESSigma-Aldrich 54457
IVISBrite d-luciferin potassium saltRevvity (former PerkinElmer)122799Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance. 
DPBSGibco21600-044
Cyclophosphamide (CTX)Sigma-AldrichC0768-5g
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD5879
(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)Sigma-Aldrich09963-25G
Benzyl alcoholSigma-Aldrich402834
Tween 80Sigma-Aldrich P1754-1L
BenznidazoleELEA
Posaconazole (Noxafil commercial formulation)Schering-Phough
GiemsaAvailable from several suppliers
gavage needle (stainless-steel straight) - 22GAAton CA2003
1 mL Syringe and 31G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 26G needleAvailable from several suppliers
1 mL Syringe and removable 24G X¾ needleAvailable from several suppliers
Sterile Syringe Filter 0.2 µmAvailable from several suppliers
A4 Matte Black paper 120gr or thickerPaper Color/ Canson (Available from several suppliers)
aluminum foilAvailable from several suppliers
Neubauer chamberAvailable from several suppliers

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